王营+李浩华+谭国慧+李赛妮+严明理+章卫民

[摘要] 从广藿香的根、茎、叶中共分离得到72株内生真菌，根据ITS序列分析鉴定为25属40个种，其中拟茎点霉属Phomopsis、刺盘孢属Colletotrichum、镰刀菌属Fusarium为优势种群；广藿香内生真菌的分布存在明显的组织特异性，以茎中内生真菌的分布最多，占分离菌株总数的78%；活性测试结果显示共有15个属34株内生真菌至少对1种供试菌具有抗菌活性。结果表明广藿香内生真菌多样性丰富，部分菌株具有明显的抑菌活性，值得进一步深入研究。

[关键词] 内生真菌； 多样性； 广藿香； 抗菌活性

[Abstract] Seventy-two strains of endophytic fungi were isolated from roots， stems and leaves of Pogostemon cablin and identified as 40 species of 25 genera based on ITS sequences analysis. Among them， Phomopsis， Colletotrichum and Fusarium were dominant genera. Distribution of endophytic fungi in P. cablin showed obvious tissue-specificity， and more strains were isolated from stems with an isolation rate of 78%. The bioassay results indicated that 34 strains of 15 genera displayed antimicrobial activities against at least one of test bacteria or plant pathogenic fungi. The results obtained in this study showed that endophytic fungi in P. cablin were rich in species diversity， and some strains exhibited strong antimicrobial activities， which deserve further research.

[Key words] endophytic fungi； diversity； Pogostemon cablin； antimicrobial activity

植物内生真菌是指生长在植物体的根、茎、叶及果实等组织和器官内的一类真菌，是植物微生态系统中的重要组成成分，在进化过程中与宿主植物形成了互惠共生的关系[1]。内生真菌不但能产生结构丰富多样的次生代谢产物，已从中分离出多种生物活性物质，包括抗菌、抗肿瘤、抗氧化等天然化合物[2-3]，而且对植物的生长发育、活性成分的积累及植物抗逆性具有重要影响[4]。药用植物中同样存在着大量的内生真菌[5]，中药成分的形成、种植、抗病性及道地性可能都与内生菌有密切的关系[6]，因此，研究药用植物内生真菌资源的多样性不仅可以丰富真菌资源宝库，而且对于中药资源的保护和可持续利用具有重要的意义。

广藿香Pogostemon cablin （Blanco） Benth.为唇形科Lamiaceae刺蕊草属Pogostemon Desf.植物，是十大广药之一，其入药最早记载于唐代《新修本草》和《千金翼方》中，自宋、金、元以来已广泛应用于临床。它具有芳香化浊、和中止呕以及发表解暑的功能，用于胸闷不舒、寒湿闭暑、腹痛吐泻、鼻渊头痛的治疗[7]。现代药理学研究表明，广藿香具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、杀虫等作用[8-11]。目前，对广藿香内生真菌的研究鲜有报道，为了探讨广藿香内生真菌的多样性、群落组成及其分布特征，本研究对其内生真菌进行了系统的分离和鉴定，并对分离得到的菌株发酵粗提物进行抗菌活性研究，旨在筛选出具有良好抗菌活性的菌株，为广藿香内生真菌的资源保护和开发利用提供基础资料和科学依据。

1 材料

1.1 仪器与试剂 RE-2000型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；超净工作台，上海恒益科技有限公司；YXQ-WY21-600电热高压蒸汽灭菌锅，广州市华南医疗器械有限公司；THZ-C-1摇床，广州市正一科技有限公司；Mastercycler gradient5331 PCR仪，Eppendof公司；EPS 3501电泳仪，Amersham Pharmacia Biotech公司。氨苄青霉素、硫酸卡那霉素、二甲基亚砜（DMSO），均购自Sigma公司；Taq酶、DNA提取试剂盒，均购自大连宝生物工程有限公司；乙酸乙酯，广州化学试剂厂。

1.2 植物与内生真菌 广藿香植物于2012年10月采自广东阳春市马水镇，由广东药科大学中药学院严寒静副教授鉴定为P. cablin。内生真菌分离自健康的广藿香根、茎、叶。植物标本和分离菌株保存于广东省微生物研究所。

1.3 供试指示菌 细菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）、大肠杆菌（Escherichia coli，EC）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，BS）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）。植物病原真菌：胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides，CG）、荔枝霜疫霉（Peronophthora litchic，PL）、鏈格孢（Alternaria alternata，AA）、柱枝双孢霉（Cylindrocladium scoparium，CS）、新月弯孢霉（Curvularia lunata，CL）。所有菌株均保存于广东省微生物研究所。

1.4 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 3 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，Vit B1 10 mg，琼脂20 g，蒸馏水1 L；察氏琼脂（CDA）培养基：NaNO3 3 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O4 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4 0.01 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g；营养琼脂培养基：蛋白胨5 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L。

2 方法

2.1 内生真菌的分离 取新鲜的广藿香根、茎、叶，用自来水冲洗干净，置于滤纸上自然晾干，放入0.1%的升汞溶液中浸泡5～7 min后用无菌水漂洗4次，再放入75%的乙醇溶液中浸泡3～5 min后用无菌水漂洗3次。叶片用无菌剪刀剪去边缘后，剪成约0.5 cm×0.5 cm的方块；根和茎用剪刀剪掉头尾部分，将中间部位剪成约1 cm长的小段。将上述组织块分别置于PDA和CDA培养基（含20 mg·L-1硫酸卡那霉素和20 mg·L-1氨苄青霉素）中，同时将上述经表面灭菌后不做任何处理的材料直接接种于对应培养基中作消毒效果检测，26 ℃恒温培养3～7 d后挑取形态不同菌落转接到新鲜培养基上，纯化后转接至斜面培养基中，4 ℃冰箱保存备用。

2.2 菌株的分子鉴定 将分离所得的内生真菌按常规方法用真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，作为PCR扩增的模板。PCR扩增采用真菌rDNA内转录间隔区（rDNA ITS）通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，正向）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，反向）扩增分离菌株的rDNA ITS区。PCR采用20 μL 反应体系，通过Ex Taq（TaKa-Ra）进行。反应条件：93 ℃预变性3 min；93 ℃变性45 s，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸1.5 min，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物由上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。获得的序列通过BLAST程序在GenBank上进行相似性序列检索分析，对分离菌株进行鉴定。

2.3 内生真菌的液体培养及粗提物制备 挑取经活化的内生真菌菌丝体接种于PD液体培养基中，28 ℃，120 r·min-1摇床培养7 d，过滤，收集发酵液并用乙酸乙酯萃取3次，萃取液于旋转蒸发仪浓缩至干，得提取物浸膏。将提取物浸膏用DMSO溶解配制成50 g·L-1，备用。

2.4 抗细菌活性测定 将各供试细菌接种于营养琼脂液体培养基中，37 ℃培养24 h，用无菌生理盐水稀释，配制成1×105～1×107 CFU·mL-1的菌液。吸取1 mL菌液于灭菌的培养皿中，倒入已冷却到合适温度的营养琼脂培养基中，混合均匀，放置己灭菌的直径为6 mm滤纸片，分别吸取提取液5 μL滴加于滤纸片上，以DMSO代替样品提取液作空白对照，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以氨苄青霉素作阳性对照，大肠杆菌、铜绿假单胞菌以硫酸卡那霉素作阳性对照。置37 ℃恒温箱培养16～24 h，观察细菌生长情况并测量抑菌圈大小。

2.5 抗植物病原真菌活性测定 在含有PDA培养基的平皿中央分别接入直径为4 mm的供试真菌菌饼，在菌饼四周均匀放置4片滤纸片，并在滤纸片上滴加5 μL提取液，以DMSO代替样品提取液作空白对照。置28 ℃恒温箱培养3～5 d，用十字测量法记录菌饼生长直径，计算抑制率。

抑制率=（1-处理组纯生长量/对照组纯生长量） ×100%

3 结果

3.1 内生真菌表面消毒效果 经表面灭菌后不做任何处理的广藿香组织接种于相应的培养基中，恒温箱中培养3～5 d后，没有观察到任何真菌的生长，表明经过表面消毒后的样品，排除了其表面附生菌的影响，分离的菌株均来自植物组织内部。

3.2 内生真菌的分离鉴定 从广藿香根、茎、叶中分离得到72株内生真菌菌株（A593-A670），经ITS序列分析鉴定为25属40种，分离菌株中确定到种的有36株；确定到属的有4株，分别为齿毛菌Cerrena sp. A593、多节孢Nodulisporium sp. A600、间座壳Diaporthe sp. A603、拟茎点霉Phomopsis sp. A604。菌株A641，A644与最相似物种的相似率较低，分别是95.0%，96.8%，为最相似种的参照种（表1）。

3.3 内生真菌的主要类群分析 广藿香内生真菌的种类丰富，但各类群的数量差异较大，其中拟茎点霉属、刺盘孢属和镰刀菌属为广藿香的优势种群，相对频率为12.5%，11.1%，11.1%，远远高于其他类群，其他类群的相对频率均低于8.5%。

广藿香内生真菌分布具有明显的组织特异性。从根中分离到5株内生真菌，占分离菌株总数的7%，分属于4个类群，包括镰刀菌属、茎点霉属、曲霉属和Acrocalymma属；从茎中分离到56株内生真菌，占分离菌株总数的78%，分属于20个类群，包括拟茎点霉属、刺盘孢属、镰刀菌属、棒孢菌属、间座壳属、小不整球壳属、毛壳属、弯孢属等，从叶中分离到11株内生真菌，占分离菌株总数的15%，分属于6个类群，包括曲霉属、毛壳属、弯孢属、原毛平革属、齿毛菌属、黑孢属（表2）。

3.4 抗细菌活性测定 72株内生真菌中有10个属20株真菌提取物至少对1种供试细菌有抗菌活性（抑菌圈直径≥8 mm），占分离菌株总数的27.8%，对2种供试细菌有抑制作用的活性菌株有14株，占分离菌株总数的19.4%。抗BS的活性菌株有18株，占分离总株数的25.0%，其中具有显著抑制活性（抑菌圈直径≥15 mm）的菌株有8株，分别是A593，A625，A611，A661，A654，A640，A606，A594；抗SA的活性菌株有16株，占分離总株数的22.2%，其中具有显著抑制活性的菌株有4株，分别是A593，A625，A594，A606；抗EC的活性菌株有2株，分别是A611，A625。所有内生真菌的提取物对铜绿假单胞菌均没有抑制作用（表3）。

3.5 抗植物病原真菌活性測定 72株内生真菌中共有14个属31株真菌提取物至少对1种供试病原真菌有抑制作用（抑制率≥50%以上），占分离菌株总数的43.1%，其中对所有供试病原真菌都有抑制作用的菌株有4株，分别是A607，A633，A643，A663；抗PL活性显著（抑制率≥95%以上）的菌株有6株，分别是A593，A625，A654，A616，A661，A663；抗CL，CS活性显著（抑制率≥80%以上）的菌株分别有2株，1株，分别是A607，A643，A633（表4）。

4 讨论

本研究从广藿香根、茎、叶中分离获得72株内生真菌，经ITS序列分析鉴定为25个属40个分类单元，其中拟茎点霉属、刺盘孢属和镰刀菌属为优势菌群，而且这些内生真菌在广藿香不同组织中的分布存在明显的组织特异性，其中茎中内生真菌类群最为丰富，叶和根中分离的内生真菌类群较少。通过活性测试发现广藿香内生真菌拟茎点霉、镰刀菌、曲霉菌具有显著的抗菌活性，为进一步发掘活性次级代谢产物提供了理论依据。

拟点茎霉是常见的植物内生真菌，能产生多种活性代谢产物。Wagenaar等[12]从薄荷Mentha haplocalyx中分离到的拟茎点霉属内生真菌能产生一种具有临床应用前景的新抗生素dicerandorls；Silva等[13]从美丽决明Cassia spectabilis的内生真菌P. cassiae发酵液中得到的杜松烷倍半萜类化合物3，11，12-trihydroxycadalene对球孢枝孢Cladosporium sphaerospermum和枝状枝孢C. cladosporioides具有明显的抑制活性。镰刀菌也是常见的植物内生真菌，该属内生真菌产生的代谢产物对病原菌具有抑制作用。如邵志宇等[14]从互花米草Spartina alterniflora内生真菌Fusarium sp. F4中分离得到的白僵菌素Ⅲ对结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis的MIC为5 mg·L-1；刘兆迪等[15]从药用植物三尖杉Cephalotaxus fortunei中分离得到的内生真菌F. tricinctum对B. subtilis，E. coli，Salmonella typhl具有明显的抑制作用。曲霉是分离频率很高的一类内生真菌，能产生具有抗菌活性的代谢产物。Liu等[16]从狗牙根Cynodon dactylon内生真菌A. fumigatus中分离到的asperfumid具有抗白色念珠菌活性，其MIC为75 μg·L-1；周凤等[16]从黄芪内生真菌Aspergillus sp.中分离到的cyclotryprostatins B对B. subtilis，E.coli的MIC值均为1 mg·L-1。

植物内生真菌不但可以产生重要的活性次级代谢产物，而且还能对药用植物挥发油成分产生重要影响。研究表明，亚洲薄荷中的2种内生真菌对薄荷挥发油中的桉油素和氧化胡椒烯酮含量能产生显著性影响[17]，苍术中的3种内生真菌能改变苍术挥发油中4种主要活性成分苍术酮、苍术醇、β-桉叶醇及苍术素的相对百分含量[18]。本研究分离获得的内生真菌还将为进一步开展广藿香植物内生真菌与其挥发油中成分的相关性研究奠定了基础。

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