饶丽+金小冬+李青南+卢丽

[摘要]采用正交试验方法研究愈骨葆方的最佳水提取工艺。通过血清药理学，以提取物对成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）的活性的影响作为考察指标，采用L9（34）正交表设计试验，对加水量（A）、加热时间（B）、浸泡时间（C）及煎煮次数（D）4个因素进行考察，分析最佳提取条件，并验证该工艺的有效性。通过该实验得出愈骨葆方最佳提取工艺：8倍加水量，加热时间60 min，浸泡时间30 min，煎煮1次。按此工艺获得的愈骨葆方含药血清能显著地促进成骨相关基因的转录。该实验建立了愈骨葆方的最佳提取工艺，为该复方中药的开发利用提供了试验依据。

[关键词]愈骨葆方； 正交试验； 水提取工艺； 成骨细胞； 碱性磷酸酶

Optimize aqueous extract protocol for Yugubao formula by

orthogonal experiment design

RAO Li， JIN Xiaodong， LI Qingnan， LU Li*

（College of Life Science and Biological Pharmacy， Guangdong Pharmaceutical University， Guangdong Provincial

Key Laboratory of Biotechnology Candidate Drugs， Guangzhou 510006， China）

[Abstract]To determine the optimum aqueous extract protocol for Yugubao traditional Chinese medicines formula by using orthogonal experiment design Through serum pharmacology research， L9（34） orthogonal design with single factor investigation was used to optimize the aqueous extract protocol for Yugubao formula The effect of water extraction on activity of alkaline phosphatase （ALP） in osteoblast was referred as the evaluation index for investigating four factors： water consumption （A）， heating time （B）， soaking time （C）， and number of decocting （D）， analyzing the optimum extraction conditions， and verifying the effectiveness of this process The optimum aqueous extract protocol for Yugubao was as follows： adding 8 times water into Chinese medical materials， heating for 60 min， soaking for 30 min， and decocting for 1 time The drug serum of this aqueous extract of Yugubao could significantly upregulate the osteogenic genes expression The optimum aqueous extract protocol for Yugubao formula was established in this experiment， providing evidence for the development and utilization of Yugubao traditional Chinese medicines formula

[Key words]Yugubao formula； orthogonal design； aqueous extract； osteoblast； ALP

近年來，骨科创伤的发生率高居不下，首要原因是交通事故，随着工业及城市化高速发展，骨科创伤的患者也大量增加，尤以重症患者增长率为高。骨科创伤给病人造成极大痛苦的同时，也带来的巨大经济损失，这使得骨伤骨折治疗药物的研发与产业化越来越受到重视。中医对骨折的认识与治疗历史悠久，接骨类中药作为中药的优势药种，具有西医西药难以比拟的优势。这使得开发更有效、更安全的新型接骨类中成药成为趋势。愈骨葆方，系由骨碎补、杜仲、续断等组成的内服方剂，此方根据“君、臣、佐、使”的配伍，采用补肝肾，益精血，调理阴阳的治则，兼顾头颈、背腹及四肢，辅以养血活血，强筋壮骨之法，兼有止痛镇静的作用。已在民间应用近70余年，对骨伤骨折有确切的疗效，尤其是对老年骨质疏松合并骨折的患者，能明显加快骨痂生长，缩短骨折愈合时间，与化学药乃至同类中药相比，都具有较强竞争力。

为了确保愈骨葆方经水提取后能维持稳定的药效，本实验旨在愈骨葆方最佳的水提工艺。本研究采用传统的正交试验设计法，结合单因素考察，选用L9（34）正交设计试验，通过血清药理学，即以含药血清代替中药粗提物作为药物源加入离体反应系统中从而研究其药理作用的一种半体内实验方法，以愈骨葆方提取物制备的大鼠含药血清对成骨细胞分化值[1]的高低作为考察指标，对加水量（A）、加热时间（B）、浸泡时间（C）及煎煮次数（D）4个因素进行优化，筛选出愈骨葆方的最佳水提取工艺。

1材料

11愈骨葆方复方包含骨碎补、杜仲、续断、千年健、川芎、玄胡、细辛，所需饮片均购于广东大参林药房，由广州市番禺区何贤医院药房李艳卿副主任药师鉴定，低温干燥避光保存。

12动物新生24 h内SD大鼠乳鼠6只，雌雄兼用，每只约15 g。SPF级SD雌性大鼠30只，体重230～250 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号SCXK（粤）20080020。

13试剂DMEM高糖培养基（Hyclone公司，批号SH30021 01B）、025%胰酶溶液（GIBCO批号25200056）、胶原酶Ⅰ（Invitrogen公司，批号17101015）、PBS缓冲液（Hyclone公司，批号SH30256 01B），β甘油磷酸钠（Sigma公司，批号BCBB4821），L维生素C（Sigma公司，批号037K02501），地塞米松（Sigma公司，批号100827），碱性磷酸酶（ALP）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号A0591）。

2方法

21成骨细胞（osteoblasts，Ob）原代培養及鉴定无菌条件下取出新生鼠的颅盖骨，置入冷PBS中，剔除附着的结缔组织。用PBS液清洗3次，将其置入盛有DMEM培养基的培养皿中，剪成05 mm×05 mm大小碎块，加入025%胰蛋白酶5 mL，37 ℃下预消化20 min[2]，血清终止消化，弃上清液，将骨片移入5 mL 01%Ⅰ型胶原酶溶液中，37 ℃震荡消化分离细胞60 min，将含细胞的消化液1 000 r·min-1离心10 min，吸去上清液，沉淀的细胞团块用培养液制成细胞悬液，剩下的骨片用含5 mL 01%Ⅰ型胶原酶溶液重复消化分离细胞60 min。将2次消化获得的细胞悬液混匀，计数。按需要密度接种于培养瓶或皿，置5%CO2培养箱中培养。24 h换液1次，去除不贴壁的死亡细胞，以后每2～3 d换液1次[34]。取3～5代的细胞，进行碱性磷酸酶染色，阳性颜色显示为蓝色。倒置相差显微镜下观察，拍照。

22大鼠给药量的计算参考《药理实验方法学》，采用标准动物的等效剂量折算系数法[5]，折算出大鼠的给药量。计算方法：大鼠的剂量（mg·kg-1）=人的临床剂量（mg·kg-1）×70 kg×0018/02 kg=63×人的临床剂量（mg·kg-1）。其中0018为折算系数；人体重按70 kg计算，大鼠体重按02 kg计算。愈骨葆方临床给药量1 d为0214 g·kg-1，所以大鼠的剂量为135 g· kg-1。由于大鼠灌胃量为每100 g体重1～2 mL[5]，所以拟定药物质量浓度为02 g·mL-1。按大鼠平均体重为250 g计算，每天灌胃1次，每次灌胃量约为17 mL。

23正交试验设计选取正交试验设计优化的方法，结合生产实际中的操作和成本问题及该中药复方的特性，采用水提工艺，确定加水量、加热时间、浸泡时间、煎煮次数4个因素，以L9（34）正交表设计试验，通过血清药理学，以提取物对成骨细胞分化值高低作为考察指标。影响因素及水平见表1。按比例称取该中药复方各单味药饮片共900 g，分成9等分每份各100 g，按照所设计的试验处理组合方法煎煮，8层纱布过滤，合并滤液并水浴浓缩至02 g·mL-1，即浓缩液为50 mL。

24大鼠含药血清制备取大鼠30只，随机分为10组，每组各3只，中药复方组按上述正交试验得到的9组愈骨葆方浓缩液进行灌胃，空白对照组灌等量的生理盐水。每天1次，连续5 d，末次灌胃后1 h心脏取血[6]，室温下静置4 h，3 000 r·min-1离心15 min，取血清，每组血清混匀，于56 ℃水浴30 min灭活，-20 ℃保存。配制时采用022 μm的微孔滤膜过滤，与无血清的DMEM配成10%的含药血清培养基和空白血清培养基。

25成骨细胞培养上清液ALP含量的测定取对数生长期良好的F2代成骨细胞经025%胰蛋白酶消化传代，培养液重悬细胞、计数，以相同密度（2×103个/孔）接种于96孔培养板，容积为100 μL/孔，常规培养24 h，待细胞贴壁后换入上述制备的含药血清培养基和空白血清培养基培养细胞，一共分为10组，每组设5个复孔。48 h后ALP试剂盒检测。检测各组520 nm培养成骨细胞上清的ALP吸光度（A）[78]。数值大代表药效越强。

26Real timePCR按经优化后的方法提取愈骨葆方水提物，给大鼠灌胃后获得含药血清，将含药血清加入成骨细胞培养基，空白血清作为对照组。成骨细胞经含药血清及空白血清处理3或7 d。Trizol提取细胞总RNA，取1 μg RNA用于逆转录后进行Real timePCR检测，Real timePCR引物序列见表2。检测结果与内参βactin进行比较，相对定量。

3结果

31成骨细胞鉴定

倒置相差显微镜下，刚接种的成骨细胞呈球形，悬浮于培养液中并逐渐沉降贴壁，24 h存活细胞已完全贴壁展开。展开后的细胞形态不规则，多呈三角形、多角形，有较多突起，单核呈卵圆形，含1～2个核仁，胞浆丰富、清晰，见图1，2。

32空白血清以及正交试验

得到的9组愈骨葆方含药血清对成骨细胞培养上清液ALP含量的影响见表3，正交试验得到的9组愈骨葆方含药血清，除方案7以外，其他各组方案均能增加成骨细胞培养上清液中ALP含量，与对照组比较差异显著（P<005，P<001）。

33水提L9（34）正交试验

试验数据用正交试验设计软件进行分析，结果见表4，方差分析结果见表5。由表4可知，最佳提取工艺组合应为A1B2C1D1，即加8倍水，加热60 min，浸泡30 min，提取1次。表5方差分析表明，C>A>D>B，说明浸泡时间对Ob分化值影响最大，其次为加水量和煎煮次数，加热时间影响较小；F检验结果表明，浸泡时间对成骨细胞分化值影响显著，其次为加水量、煎煮次数和加热时间。

34愈骨葆方含药血清对成骨功能相关基因表达的影响

按最佳水提工艺提取的愈骨葆方水提物，经大

鼠灌胃后得到含药血清能显著地促进成骨细胞中成骨功能相关基因表达，见图3。Real timePCR 检测结果表明，与对照组相比，该愈骨葆方含药血清显著地提高成骨细胞关键转录因子Runx2和Osx的转录水平，同时显著地促进成骨细胞标志基因ALP，Col I，OPN，OCN的转录。

4讨论

本课题研究的中药组方——愈骨葆方，经过民间长期实践验证，是具有确切接骨作用的中药组方，也是传统医药中值得大力发扬的优势药物。而目前制约新型中成药开发最大的障碍就是对复方中药组方的分子作用机制不明，以及中成药的药效不稳定，这涉及药效研究与药物制剂两大方面的问题。本研究的目的就在于明确愈骨葆方的最佳水提工艺，为后续开展药效学评价提供实验依据。

愈骨葆方中含量最大的3味“君药”分别是骨碎补、杜仲和续断，其中骨碎补主要含有黄酮、三萜、酚酸及其苷类化合物，现代药理及临床研究表明，骨碎补具有良好的促进骨折愈合、抗骨质疏松等活性[2]。杜仲主要含有木脂素类、环烯醚萜类、生物碱类、挥发油类，对成骨细胞有明显的促进细胞增殖的作用[9]。续断具有复杂和多样的化学成分，主要含有三萜皂苷类、环烯醚萜类、生物碱类、挥发油类等，能有效促进成骨细胞的分化、增殖，可能是该药促进骨折愈合、防治骨质疏松的机制之一[12]。但由于中药成分众多，中药复方配伍更是复杂多变，除了有效成分外，很多杂质，如鞣质，电解质等，或是药物的酸碱度都可能会对体外的细胞、器官或组织等产生一些不必要的影响，制约着体外研究的进行。中药血清药理学的出现在很大程度上克服了中药复方及粗提物在体外研究时的不便，具有可控性好，重复性高，可以减少各种干扰因素的影响，使得中药复方药理作用机制的深入研究成为可能[13]，所以采用中药血清药理学的方法去评价筛选愈骨葆方的最佳水提工艺。

中药血清药理学是由日本学者田代真一于1987年首次提出的，是为了研究中药复方而诞生的一种新的体外实验方法[10]。它能透过有效成分在血中的动态变化、相互作用及与药效的相互关系，更好地反映中药复方的配伍原则和药物的量效关系，并在一定程度上揭示中药及其复方在胃肠内处置过程中活性成分的转化与改变[13]。作为愈骨葆方中的主要成分，有研究证实骨碎补总黄酮含药血清具有促进成骨细胞增殖、促进细胞分化成熟，以及抑制成骨细胞发生早期凋亡的作用[14]；而杜仲水提物含药血清能促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，并刺激细胞增殖[15]；这提示愈骨葆方含药血清可能含有相似活性物质而对成骨细胞分化具有促进作用。

本次实验通过正交试验，以愈骨葆方含药血清对成骨细胞分化值高低作为考察指标，筛选出愈骨葆方的最佳水提工艺。最后采用Real timePCR法去验证正交实验所获得的愈骨葆方水提物含药血清的促成骨功能。其中，Runx2和Osx是成骨细胞分化的关键转录因子，是其分化与成熟早期的特异性标志物。Col Ⅰ和ALP 是成骨细胞分化成熟的重要标志物。OPN和OCN则是成骨细胞分化晚期的特异性标志，一般在骨矿化是达到表达峰值。愈骨葆方含药血清显著促进这些成骨功能相关基因的转录，表明该含药血清显著地促进成骨细胞的分化成熟。

综上，本实验采用含药血清法及正交实验法确立了愈骨葆方的最佳水提取工艺，并验证了该工艺的有效性，这为愈骨葆方后期的系统药效学评价及药物开发提供了有力的实验依据。

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[责任编辑孔晶晶]

[收稿日期]20160812

[基金项目]国家自然科学基金青年基金项目（81203003）

[通信作者]*卢丽，副教授，硕士生导师， Email：541608180@qqcom

[作者简介]饶丽，硕士研究生，Email：1961874835@qqcom