周海娇　何木　王晨阳　石博文

摘要：近几年，微生物发酵技术在相关工程技术领域已经获得了相当广泛的应用，尤其是在医药领域的应用非常普遍。随着微生物科学的不断进步，人们对微生物发酵工艺的研究也越来越加深入。基于此，文章首先分析了培养基与培养条件对微生物发酵的影响，然后探讨了微生物发酵工艺优化的方法，以期为相关研究提供一些理论借鉴。

关键词：微生物；发酵工艺；工艺优化；培养基；培养条件 文献标识码：A

中图分类号：TQ920 文章编号：1009-2374（2017）01-0031-02 DOI：10.13535/j.cnki.11-4406/n.2017.01.015

根据已有的相关参考文献可知，微生物发酵影响的因素包括发酵培养基中的碳源、氮源，无机盐，pH值以及温度等，本文对这些影响因素展开了详细的研究。微生物发酵工艺的优化可以有效地提升发酵生产效率，进而使得发酵生产成本有效降低。针对于此本文探讨了正交试验设计法、响应面设计法以及Plackett-Burman设计法等微生物发酵工艺的优化方法。

1 培养基对发酵的影响

微生物发酵的培养基在微生物生长或者代谢时提供所需的营养物质和能量，对发酵产物的生物合成效率以及保障产品的质量可谓是意义重大。在微生物发酵中由于菌种和发酵条件的差异以及发酵阶段的不同，所需的培养基成分也有所差异。在通常情况下，碳源、氮源、無机盐以及生长因子是微生物生长的四大营养要素。

1.1 发酵培养基碳源和氮源的选择

碳源用于提供微生物能量来源、构建细胞以及形成产物。碳源包括单糖、双糖、多糖、天然复合物、油脂等，比如葡萄糖、蔗糖、淀粉以及豆油等。氮源是微生物蛋白质和其他含氮有机物的重要来源，与此同时，氮源也参与形成含氮产物。氮源包括无机氮源以及有机氮源，比如氨盐、硝酸盐、蛋白胨以及豆粉等。需要保持培养基配方中碳/氮源比例均衡，从而保证满足菌体的正常生长，同时提高产物的合成速率。

1.2 发酵培养基中无机盐对发酵的影响

无机盐对代谢产物的生成及微生物的正常生长都具有相当重要的影响。在微生物的生长代谢过程中，磷参与了微生物细胞中核酸等辅酶的构成，是微生物能量代谢、生长的重要因素之一。在苏云金芽抱杆菌的发酵产物苏云金素的分子结构中包含磷酸根，所以在其发酵培养基中添加更多磷酸盐，更有利于产物苏云金素的合成。钙离子在微生物发酵过程中的主要作用是调节细胞的生理状态，比如说维持细胞的胶体状态、降低细胞膜的通透性等。与此同时，在大多数发酵培养基里面，添加适量的CaC03，能够对发酵液含菌量的变化起到相当明显的影响，其主要原因是CaC03的添加对发酵液的pH值具有非常良好的缓冲作用，从而大大改善了菌体的生长环境。镁元素是许多酶的催化剂。锰、锌、铁、钼以及钴等元素是微生物所需要的微量元素。已有大量的相关研究表明，锰离子是枯草芽抱杆菌生长必不可少的元素，有很多相关方面的学者及研究人员通过研究指出，将适量的MnCl2添加到发酵培养基里面，能够使枯草芽抱杆菌发酵产物抑菌物质活性得以有效地提升。

2 培养条件对发酵的影响

2.1 种子质量对发酵的影响

微生物发酵中接入的种子质量对菌的生长以及产物的合成具有非常大的影响。种子的质量取决于以下两个方面，其分别为接种量以及接种的种龄。在发酵培养基中接入合适的接种量以及种龄适宜的优质种子液，能够使目标微生物更加迅速地进入到对数生长期，从而使发酵周期大大地减短，进而促使产物质量得以有效提升。如果种龄过长则会直接导致菌体过早的发生衰退，菌体的生产能力也随之而有一定程度的下降；如果种龄过短，则会直接导致菌体生长缓慢，产物合成时间大大推迟。若接种量过小，那么便会使得菌体细胞的生长量变小，从而使得对数生长期的时间、发酵时间有所延长，进而对一些酶及产物的生成造成极为不利的影响；如果接种量过大，那么便会直接加快微生物培养基的消耗速度，促使菌体生长过快，进而使得菌体提前进入到稳定期与衰亡期，对产物的合成造成极大的负面影响。

2.2 温度对发酵的影响

温度是保证酶活性的重要条件之一。过高的温度环境会对微生物细胞内的酶活性造成一定程度的破坏，严重地抑制微生物的正常生长，并且微生物细胞内的蛋白质在过高的温度环境下极易发生凝固或者变性，最终造成细胞死亡；而过低的温度环境也会对微生物的生长造成较大程度的抑制作用，故在发酵过程中必须保证最为适宜的温度环境。不同微生物菌种的生长温度不同，而生长与产物合成阶段的最适温度也有差异。在发酵温度的设计过程中要综合考虑其他的发酵条件及因素，比如培养基成分、能源消耗、发酵周期和产率水平等，必要时还可以考虑变温培养。

2.3 pH值对发酵的影响

最适pH值在很大程度上会直接影响到不同种类微生物生长以及产物的合成。pH值对微生物的影响主要是影响各种酶的生命活力，进而使得微生物的新陈代谢与生长繁殖发生较大的改变；除此之外，pH值对营养物质的利用以及细胞结构也有相当重要的影响。pH值会显著地影响培养基中的营养物以及中间代谢产物的解离，进而使微生物对这些物质的利用与吸收发生一定的改变。常亚飞等人在探究苏云金芽抱杆菌的过程中发现其芽抱萌发率在pH值7.0时最高，其芽抱萌发率在pH值过大或者过小时仅为40%，除此之外，若培养基pH值过高或者过低，还会直接影响到毒素产量，甚至有可能导致完全不产生伴胞晶体毒素。

2.4 溶氧对发酵的影响

溶氧是好氧微生物生长所必须的关键因素之一，只有提供足够量的氧才能维持菌的正常生长、代谢。溶氧对次生代谢产物的合成途径影响显著，而且还会对代谢的合成速度造成一定程度的影响。如果氧不足，那么便会造成微生物对营养物质的有氧氧化过程不能彻底地进行，从而影响发酵液pH值，产生有毒物质，与此同时，还会影响产物合成所需的前体物质的积累，进而影响菌体的生长以及产物的生成。在微生物发酵的过程中，通过调节通气量、搅拌速率、罐压可以有效控制和保证氧的供给。摇瓶发酵可以采取降低装液量、增加转速来有效地增加溶氧量。叶云峰等人通过实验研究发现，装液量对枯草芽抱杆菌B47产抗菌物质的影响是最为显著的，菌体生成产物的能力随装液量的减少而大大增多，这充分地说明溶氧对产物合成具有正面的影响。

3 微生物发酵工艺优化的方法

通常情况下，微生物发酵工艺优化可以从培养基成分比例及培养条件两个方面进行优化。最近几年以来，随着统计学在微生物发酵领域的有效应用，优化方法从单因子设计法逐步发展成为正交试验设计、均匀设计等方法，更加系统高效。愈来愈多的研究人员通过统计软件对试验结果进行数学模拟与优化，利用Plackett-Burman试验设计方案来对优化因子进行科学的筛选，再在中心组合实验设计基础上采用响应面分析法以达到优化的目的。本文对目前集中比较常用的优化方法进行了比较详细的探讨。

3.1 正交试验设计法

正交试验设计法是利用正交表来分析多因素问题，通过多因素多水平实验得出相应的结果，然后再通过直接对比与直观分析来找出最佳的因素水平组合，通过这种方法可以对影响微生物发酵的主要因素进行确定。正交试验设计法具有方法简单、效率高以及工作量小等許多显著的优点，所以在对微生物发酵工艺进行优化的过程中，正交试验设计法是应用得最为普遍的方法。

3.2 Plackett-Burman设计法

Plackett-Burman法主要针对因子数较多且未确定众因子相对于响应变量的显著影响，采用的试验设计方法。能够及时有效地筛选出对试验结果具有显著影响的关键因素。在通常情况下，使用Plackett-Burman设计法开展的N次试验最多能够研究（N-1）个因素，对每个因素取两个水平，通常是设低水平为原始培养条件，高水平为低水平的1.25倍，通过对各个因素两水平的差异与整体的差异进行对比分析来对因素显著性进行确定。需要加以注意的是，如果因素水平选取得不合适有可能导致Plackett-Burman试验结果无效，从而需要重新选取因素来进行再一次的试验；如果Plackett-Burman试验的模型有效，那么则可以确定对试验具有显著影响的因素，然后下一步可以通过开展响应面设计等方法来筛选出最优的条件。袁辉林等利用Plackett-Burman设计方法获得了预期结果。

3.3 响应面设计法

响应面设计法主要结合统计分析、数学建模等方法经过试验设计来对相关数据进行分析，并利用多元二次回归方程来拟合函数关系，进而实现优化工艺参数的目的。响应面设计法对变量因素比较多的微生物发酵的参数优化效果是相当良好的，在Plackett-Burman试验结果的基础上，可以准确地确定出最优培养基配方、发酵因素等，从而有效地提高微生物发酵的产量。响应面设计法的适用范围是非常广泛的，其在生物学、制药、医学等方面已经获得了非常成熟的应用，且取得了良好的应用效果。

4 结语

随着科技的不断进步以及生物技术水平的持续提升，微生物发酵技术已经得到了非常广泛的发展，除了在农业与工业方面获得了广泛的应用外，其在医药领域的应用更加值得期待。利用微生物发酵技术可以有效地解决许多正常生产不能够解决的难题。合理运用微生物发酵技术，并对发酵工艺进行持续地优化与改进，可以有效地提升生产效率，推动发酵工程技术不断前进与健康发展，从而扩大微生物发酵在各领域的应用价值。

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作者简介：周海娇（1985-），女，江苏连云港人，正大天晴药业集团股份有限公司主任，工程师，硕士，研究方向：生物制药。

（责任编辑：黄银芳）