徐敏嫦+陈转艮+梁淑贞+林维茂

【摘要】 目的 探讨超高效合相色谱技术测定中药黄芪中黄酮类化合物成分的效果。方法 采用超高效合相色谱技术对中药黄芪中黄酮类化合物的成分进行测定， 选择色谱柱：Agilent Cu（250.0 mm×4.6 mm， 5 μm）；流速：1 ml/min；流动相：甲醛-水梯度洗脱；检测波长为254 mm；并选择适宜的温度。分析结果。结果 精密度实验检验结果良好， 且供试品溶液的稳定性和重复性良好， 其中算出对照品面积的RSD分别为2.5%、1.7%、1.5%、2.2%、1.8%、1.6%。结论 应用超高效合相色谱技术测定中药黄芪中黄酮类化合物的成分效果显著， 操作简便， 精确度高， 具有较强的可靠性， 是理想的测定中药黄芪中黄酮类化合物的成分方式， 值得推广。

【关键词】 超高效合相色谱技术；中药黄芪中黄酮类；化合物；成分

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.04.095

中药黄芪中黄酮类化合物的成分主要包括防风、黄氏、白术， 这些中药均为临床上治疗反复上呼吸道感染的经典药方， 其具有很好是免疫调节作用。目前， 有研究表明药理学中的黄芪中黄酮类化合物成分可大大降低患者大脑动脉栓塞率， 而且还能有效增加缺血组织抗痒化酶的水平。本文作者经过建立一组超高效合相色谱技术对中药黄芪中黄酮类化合物的成分进行检测定， 现将具体内容报告如下。

1 儀器与材料

1. 1 仪器 采用Agilent1200高效的液相仪， 系列四元梯度汞、自动进样器， 并选择二极管阵列检测器， 便于检测DAD， 然后选择天津四友化学试剂公司生产的甲醇试剂；中国药品生物制品检定所制造的黄氏甲苷对照品试剂；双蒸水；超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司， KQ-400KDE）；电子分析天平（Mettler公司， AB135-S）。

1. 2 材料 色谱纯包括甲醇、乙腈、异丙醇， 而水为超纯水， 对照品槲皮素、芒柄花素、山奈酚、芒柄花苷都是来自于中国药品生物制品检定所。甘肃和陕西产的膜荚黄氏的干燥根， 还有中国医学科学院药用植物研究所教授鉴定内蒙古产为豆科植物蒙古黄氏的干燥根， 毛蕊异黄酮苷是购自于北京恒元启天化工技术研究院， 而且纯度质量分数一般>98%。

2 方法与结果

2. 1 精密度实验 选取混合对照品储备液， 根据色谱的条件进行重复性是进样约6次， 然后分别计算毛蕊异黄酮苷、槲皮素、山奈酚、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花峰的面积， 且每次进样2 μl测定， 结果表明此方法的精密度检验较好， 毛蕊异黄酮苷、槲皮素、山奈酚、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花峰的面积分别为1.63%、1.74%、1.45%、1.50%、0.98%、1.26%。

2. 2 色谱的条件 色谱柱Agilent Cu（250.0 mm×4.6 mm， 5 μm）；流速为1 ml/min， 进样量为2 μl；流动相A为甲醛水0.1%， 流动相B为7∶3的甲酸乙腈-异丙醇梯度洗脱0.1%；检测波长为254 mm；柱温约为30℃。

2. 3 对照组品溶液与供试品溶液的制备 分别给予对照品毛蕊异黄酮苷、槲皮素、山奈酚、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花峰精密称取1.3、1.5、1.4、1.5、1.4、1.4 mg， 然后放置于1 ml的量瓶中， 再加入甲醛到刻度尺寸高度， 且摇匀使其混合， 接着配制成混合性的对照品储备液。对于供试品溶液的制备， 首先选取大约2.0 g的药材粉末， 同样精密称定， 然后放置于具塞锥形瓶里， 再加入25 ml的甲醇， 并冷制温室中保存， 超声40 min。当过滤到25 ml量的瓶子中时， 可适当加入甲醇到规定的刻度， 经过0.22 μm的微孔虑膜过滤， 随后摇匀， 最后再次取续滤液， 即可完成供试品溶液的制备。

2. 4 稳定性实验 在操作稳定性实验的过程中， 应按照供试品溶液的制备， 在温室下测定0、2、4、6、8、12、24 h供试品溶液的稳定性情况。然后以峰面积为指标对毛蕊异黄酮苷、槲皮素、山奈酚、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素的RSD进行测定， 结果测得出以上对照品的RSD分别为2.3%、1.7%、1.6%、1.5%、1.9%、2.1%， 以上数据充分说明了供试品溶液在24 h内的稳定性较好。

2. 5 重复性考察 针对供试品溶液的制备进行考察， 首先选取2.0 g的黄氏粉末， 同样按照供试品溶液的制备然后平行制备6份的供试品溶液， 并在色谱条件下分析其考察效果。然后计算出毛蕊异黄酮苷、槲皮素、山奈酚、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花峰面积的RSD， 结果计算出其面积RSD分别为2.5%、1.7%、1.5%、2.2%、1.8%、1.6%， 以上数据表明了供试品溶液的重复性良好。

3 讨论

近年来， 对于黄酮类成分含量测定方面的报道相对较多， 一般常见的为高效液相色谱法、薄层色谱法以及液相色谱串联质谱法等， 而液相色谱质谱法， 采用的仪器价格比较昂贵[1-6]， 一般在国内还没有被普遍使用；层析色谱与高效液相色谱法的特异性基本一样， 其干扰物质比较多， 而且定量不准确， 分析的时间液比较长， 不能够同时测定多种物质[2， 7]。高效液相色谱法能够通过精确调节流动相强度、压力和温度， 并且在整个分离过程中具有较好的重复性[3]。不仅如此， 高效液相色谱法还具有较高的线速度和较低的密度， 其在分离过程中具有很高的柱效， 分析速度快， 灵敏度高， 有机溶剂使用量极少[4]。与气相色谱串联质谱法相比， 其具有较高的溶解能力， 比较适用于分离难挥发和热不稳定性物质， 但是并不适合于难挥发及热不稳定物质的分离[5]。

本研究采用超高效合相色谱法同时测定黄芪中的几种主要黄酮类化合物， 实验表明， 本方法灵敏度高、操作快速准确、重复性好、实用性强， 是一种新型的分析仪器， 可为黄酮类化合物的定性与定量检测提供了广泛的选择性， 也是一种高效可行的色谱检测方法。本次实验采用的是采用超高效合相色谱法对毛蕊异黄酮苷、槲皮素、山奈酚、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素进行测定， 其中甘肃的毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷含量比陕西的高。而内蒙古黄芪的干燥根具有味甘， 性温， 归肺、脾经的效果；且具有补气固表、敛疮生肌的作用。在临床上适用于气虚水肿、气虚乏力、表虚自汗、慢性肾炎蛋白尿、糖尿病等症。该方法的精密度、重复性以及考察的结果比较稳定， 而且可靠。有研究表明[6]， 黄酮类成分作为其有效成分之一， 它不仅具有降血脂、抗菌抗病毒、抗氧自由基的作用， 而且还具有抗缺血， 以及改善血象的作用。

综上所述， 应用超高效合相色谱技术测定中药黄芪中黄酮类化合物的成分效果令人十分满意， 不但操作简便， 精确度高， 而且具有较高的可行性， 值得在临床中广泛推行。

参考文献

[1] 王波， 周围， 刘小花， 等. 基于超高效合相色谱对黄芪中5种主要黄酮类化合物的快速检测. 分析化学， 2016， 44（5）：731-739.

[2] 杨慧洁， 付娟， 张海弢， 等. 黄芪药材质量评价研究现状. 药物分析杂志， 2014， 4（26）：570-576.

[3] 雷军， 边清泉， 罗娅君. 高效液相色谱-质谱联用技术在分析中草药黄酮类化学成分方面的应用. 绵阳师范学院学报， 2012， 5（7）：51-56.

[4] 梁瑾， 封士兰， 刘小花， 等. 黄芪药材的高效液相色谱指纹图谱及主要成分的含量测定方法研究进展. 西北药学杂志， 2012， 5（12）：490-493.

[5] 李芳蓉， 刘凤霞， 刘淑梅， 等. 超声波清洗中药黄芪应测项目和方法的探讨. 畜牧兽医杂志， 2015， 5（2）：45-49.

[6] 马晓丰， 田晓明， 陈英杰， 等. 蒙古黄芪中黄酮类成分的研究. 中草药， 2005， 36（9）：1293-1296.

[7] 胡芳弟， 封士兰， 赵健雄， 等. HPLC法测定黄芪中黄酮类成分和黄芪甲苷的含量. 分析测试技术与仪器， 2003， 9（3）：173-177.