针对糖尿病创口的抑菌敷料制备及促愈合性能评价

2017-03-23高层层王富平陈忠敏

丝绸 2017年3期

关键词：丝素粉末伤口

高层层，王富平，梁敏，孟鑫，陈忠敏

(重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054)

研究与技术

针对糖尿病创口的抑菌敷料制备及促愈合性能评价

高层层，王富平，梁敏，孟鑫，陈忠敏

(重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054)

针对糖尿病伤口难愈合的问题，以丝素蛋白、壳聚糖、生物活性玻璃及聚乙烯醇为原料，采用反复冻结-解冻法制备了抑菌促愈合伤口凝胶敷料，通过测定其吸水率、保水率、透水汽性能及抑菌性能，对其进行性能表征。并构建了SD大鼠糖尿病皮肤创面模型，通过对创面愈合时间、创面愈合率进行研究，探讨了该敷料对促进糖尿病皮肤创面愈合的效果。实验结果表明，与市售的海藻酸钠敷料、生物活性玻璃粉末和医用纱布的促愈合性能相比，该敷料能加速创面的愈合，促进肉芽组织的生长。

糖尿病；创口；抑菌敷料；丝素蛋白；创面愈合；性能评价

目前，糖尿病(diabete mellitus，DM)的发病率呈逐年上升趋势，糖尿病病人伤口不易愈合，患者血液中高浓度的葡萄糖渗透到组织间，损伤机体组织和细胞的损伤修复系统[1]，并易引发伤口感染，包括革兰氏阳性球菌、格兰氏阴性杆菌在内的多种需厌氧菌和真菌的混合感染[2]，使得糖尿病人伤口难以愈合。目前，临床上使用的敷料主要有传统敷料和新型湿性敷料。传统敷料即纱布、碘仿纱条等，以传统的保持创面干燥为指导原则进行换药治疗[3]，几乎无促愈合功效。新型湿性敷料包括以透明薄膜式敷料为代表的覆盖型外层敷料；以藻酸盐敷料、伤口胶为代表的内层填塞型敷料；以银离子敷料为代表的抗菌性敷料等，以湿性愈合为原理，能创造利于细胞生长适宜的湿润环境，敷料密闭或半密闭伤口能保持伤口恒温，防止细菌及外界颗粒性异物侵入，减少伤口感染机会，促伤口愈合[4]。但其在湿润环境下吸收渗液的特性及通透性差，最终出现感染情况多，成为医学上难题。

丝素蛋白(silk fibroin, SF)是一种天然高分子蛋白质，含有18种氨基酸，具有良好的生物相容性和可生物降解性[5]，对表皮细胞的生长有促进作用[6-7]，并有助于创面愈合[8]。壳聚糖(chitosan, CS)是一种天然多糖，广泛存在于自然界，具有止痛、止血、促进伤口愈合，良好的生物相容性和抑菌性等优异的性能，非常适于作为伤口敷料的原料[9]。生物活性玻璃(bioactive glass, BG)的主要成分为SiO2、CaO、P2O5，具有独特的表面活性，钙、磷等离子沉积生成支架状羟基磷灰石层，使其具有巨大的比表面积，有利于细胞的黏附生长及血管和神经长入[10-11]。另外，生物活性玻璃在被创面组织渗液溶解后，能在局部形成碱性环境，可发挥一定的抑菌作用，利于创面愈合[12]。聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)水凝胶具有亲水性、柔软性和良好的生物相容性，被广泛应用于生物医药领域[13]。PVA水凝胶含有大量的水分，能够使伤口处保持湿润，同时可以吸收伤口渗液，保持伤口清洁。因此，天然高分子材料及生物活性玻璃的联合使用，将会为难愈合伤口的治疗带来希望。

本研究以丝素蛋白、壳聚糖、生物活性玻璃、聚乙烯醇为原料，采用冻结-解冻法制备出水凝胶抑菌敷料，并利用链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)通过葡萄糖转运蛋白进入细胞后，对胰腺胰岛素诱发的抑制作用，构建糖尿病大鼠皮肤创面模型，并研究敷料的相关性能及应用于糖尿病大鼠皮肤创面的愈合效果。

1 实验

1.1 原料与试剂

家蚕茧壳(重庆市纤检所)；透析袋(Solarbio，进口分装，标定截留相对分子质量8 000～140 000)；无水乙醇、异丙醚、无水碳酸钠、盐酸、磷酸三乙酯、正硅酸乙酯、四水硝酸钙、聚乙烯醇1799、柠檬酸、柠檬酸三钠均为市售分析纯；壳聚糖(<200 mPa·s，西亚试剂)；链脲佐菌素购于sigma；陆眠宁(吉林省华牧动物保健品有限公司)。

1.2 丝素蛋白的制备

将去除灰分和蜡质物的茧壳放0.5% Na2CO3溶液中煮沸约3 h，去除丝胶。将除去丝胶的茧壳用去离子水洗净后晾干，置于m(CaCl2)︰m(C2H5OH)︰m(H2O)=1︰2︰8的有机无机溶液中，水浴80 ℃下使丝素完全溶解，得到透明的丝素溶液，经透析、抽滤、浓缩、冷冻干燥，得到纯净的丝素蛋白粉末。

1.3 生物活性玻璃粉末的制备

将各原料按照一定比例混合均匀，室温下密闭搅拌1 h，在室温下陈化3 d，得到均匀溶胶。将均匀溶胶放入75 ℃鼓风干燥箱中1 d，得到均匀湿凝胶。将湿凝胶放150 ℃鼓风干燥箱中，得到干凝胶粉末。再将干凝胶放入马弗炉中，700 ℃维持2 h，待冷却后取出，即得到生物活性玻璃粉末。将生物活性玻璃研磨后过筛，得到粒径为75～100 μm的生物活性玻璃粉末。

1.4 抑菌促愈合敷料的制备

在室温下，将丝素蛋白溶液和生物活性玻璃混合均匀后，再加入壳聚糖溶液和聚乙烯醇溶液搅拌成混合溶液，搅拌约30 min；将混合溶液倒入模具中，于-20 ℃冷冻8～10 h，再于室温下解冻，如此反复3次，即可得到能够促进难愈合伤口愈合的敷料材料(本文称为抑菌促愈合敷料)。

1.5 动物模型构建及分组

实验选择由重庆市大坪医院动物中心提供的体重为200 g左右的雄性SD大鼠[14]，适应环境3 d，实验组喂食高糖高脂饲料，对照组喂食普通饲料，4周后腹腔注射STZ。实验前禁食不禁水12 h[15-16]，按30 mg/kg腹腔注射STZ，隔日注射，注射在腹腔同侧[17]，注射后单笼饲养。对照组按30 mg/kg腹腔注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。注射后3 d的空腹血糖≥11.1 mmol/l[18]即为成模标准。连续3周监测大鼠血糖值，实验组继续喂食高糖高脂饲料以维持高血糖。3周后，以0.6 mL/kg肌肉注射陆眠宁麻醉大鼠，将大鼠背部除毛，生理盐水擦洗干净，碘伏擦拭消毒。剪刀、镊子等浸入医用酒精中消毒。以大鼠脊柱为中线，制作三个边长约为1 cm的背部全层皮肤切除创面。按照双盲随机法，使用抑菌促愈合敷料、市售海藻酸钠敷料、生物活性玻璃粉末及医用纱布外敷创面，四者均用纱布固定，隔日换药。

1.6 创面用敷料的性能评价

为使病人在伤口愈合期间能保持伤口舒适，敷料的主要功能体现在以下几方面：①吸收伤口渗液；②提供湿润环境；③抑制细菌滋生；④促进伤口愈合；⑤提供营养物质。从以上要求可得出要测定敷料的吸水率、保水率、透水汽性能及抑菌性能。

1.6.1 吸水率和保水率的测定

室温下，将一定质量的敷料浸入去离子水中24 h，滤纸吸干表面水分称其质量为m1，滤纸包裹敷料放入离心机中离心10 min(10 000 r/min)，离心后称重为m2，将敷料放入105 ℃烘箱中3 h，直至称其质量为恒重，记为m0。其吸水率qx、保水率qb按下式计算：

(1)

(2)

1.6.2 透水汽性能的测定

配置A液(8.3 g NaCl+0.277 g CaCl2+1 000 mL去离子水)，取20 mL A液于透湿杯中，将敷料切割成杯口大小，放置杯口并用螺栓固定，将透湿杯放于37 ℃烘箱中。在实验开始前及24 h后称取透湿杯质量，减少的质量为液体透过敷料散发到环境中的质量。若透湿杯的内直径为D，24 h内减少的质量为W，敷料的透水汽性R按下式计算：

(3)

式中：R为敷料的透水汽性，g/(m2·d)；W为24 h内减少的质量，g；D为透湿杯的内直径，m。

1.6.3 抑菌性能测定

将冻干敷料材料浸入PBS缓冲液中(0.2 g/mL)，37 ℃恒温浸提24 h。以此为原液，分别得到0.2、0.1、0.05、0.025 g/mL的浸提液，分别研究对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及绿脓杆菌的抑菌性。

1.7 糖尿病模型评价

每周记录大鼠体重，测量血糖值并计算脏器系数。对比注射STZ前后大鼠体重、血糖值及脏器系数的变化。

1.8 创面愈合评价

观察术后各时间点伤口愈合情况，记录创面愈合时间。用拍照法记录创面面积，计算创面愈合率。创面愈合率/%=(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积×100。

1.9 统计学分析

各组实验数据均用(平均值±标准差)表示，所得数据均用SPSS 19.0统计软件进行统计学处理，实验组间差异的显著性用单因数方差分析进行检验，p<0.05具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 氨基酸分析结果检测

由表1分析结果显示，丝素蛋白中含有18种氨基酸，其中丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸质量分数较高，易被人体吸收利用，可为伤口处组织提供营养物质，促进伤口的愈合。

表1 丝素蛋白氨基酸组成分析结果

2.2 生物活性玻璃的XRD分析

如图1所示，生物活性玻璃呈现出宽阔、弥散、尖锐的衍射峰，说明是非晶态或无定形态无机固体颗粒。其中Si-O-Si、P-O-P、Si-O-P键的键角均在一定范围内变动，不具有固定的键角和晶格间距，使得非晶态物质具有短程有序、长程无序的结构，它们是以非晶态为主要特征。

图1 生物活性玻璃的XRD图谱Fig.1 X-ray diffraction map of bioactive glass

2.3 敷料的性能

2.3.1 敷料的吸水率和保水率

随着敷料中壳聚糖比例的增加，敷料的吸水率和保水率均增加，说明壳聚糖具有较好的吸水性能和保水性能，可有效吸收伤口渗出液，并能维持伤口处湿润，避免伤口干燥，有利于伤口的愈合。

2.3.2 敷料的透水汽性能

理想的敷料应能够将伤口透水汽率控制在一定范围内[19]：正常皮肤为204 g/(m2·d)，受伤皮肤为279～5 238 g/(m2·d)，推荐的医用敷料的透水汽率为2 500 g/(m2·d)。随着壳聚糖比例的增加，制备的难愈合伤口敷料的透水汽率减少。由表2可知，在m(CS)︰m(PVA)为4︰6时的透水汽率最接近医用敷料推荐值。

表2 抑菌促愈合伤口敷料的物理性能

2.3.3 敷料的抑菌性

图2 敷料浸提液的抑菌性Fig.2 Antibacterial property of leaching solution of wound dressing

2.4 注射STZ前后大鼠体重、血糖值的变化

图3(a)(b)为注射STZ前后大鼠的体重值变化情况。从图3(a)可以看出，在注射STZ之前，实验组和对照组的大鼠体重均呈现稳步上升趋势。从图3(b)可看出，实验组大鼠体重值呈下降趋势，而对照组大鼠体重持续上升。在注射STZ 2周内体重减少(p<0.05)，但在2周后体重明显下降(p<0.01)，可能继续喂食高糖高脂饲料使得大鼠糖尿病病情加重。图3(c)(d)为注射STZ前后大鼠的血糖值变化情况。由图3(c)可知，实验组和对照组大鼠的血糖值均维持在正常水平。从图3(d)可以看出，实验组大鼠注射STZ后，血糖值急剧上升(p<0.01)，达到了糖尿病血糖水平，继续喂食高糖高脂饲料，大鼠的血糖值亦会继续上升。对照组大鼠血糖值一直稳定在正常水平。

*表示p<0.05,**表示p<0.01 vs 对照组，w为周(即7 d)图3 注射STZ前后SD大鼠的体重及血糖值Fig.3 Weight and blood glucose level of SD rats before and after STZ injection

2.5 注射STZ前后大鼠脏器系数的变化

图4为注射STZ前后SD大鼠各脏器系数变化情况。从图4(a)可以看出，高糖高脂组与对照组肝脏系数基本一致，注射STZ会对肝脏产生损伤。从图4(b)可以看出，高糖高脂组与对照组肾脏系数基本一致，注射STZ会对肾脏产生损伤，肾脏系数呈上升趋势(p<0.05)。从图4(c)可以看出对照组大鼠与高糖高脂组大鼠脾脏系数基本一致，STZ对脾脏也有一定的影响(p<0.05)。从图4(d)可以看出，高糖高脂喂食对胸腺损伤不明显，注射STZ会对胸腺造成损伤(p<0.05)，大鼠胸腺明显萎缩，体积减小。

*表示p<0.05 vs对照组, #表示p<0.05 vs 高糖高脂组，w为周(即7 d)对照组，高糖高脂组，高糖高脂+STZ组图4 注射STZ前后SD大鼠脏器系数的变化Fig.4 Changes in organ coefficients of SD rats before and after STZ injection

2.6 大鼠创面愈合情况

通过对创面的肉眼观察(图5)可以看出，2 d时，海藻酸钠敷料组伤口处有部分肉芽组织形成，抑菌促愈合敷料组伤口表面有一层白色物质生成，生物活性玻璃粉末组也有部分白色物质生成。4 d时，抑菌促愈合敷料组创面减小，生物活性玻璃粉末组创面也有减小，其他两组均未发生明显变化。8 d时，抑菌促愈合伤口敷料组创面明显减小，肉芽组织充满创面，创面颜色变淡，海藻酸钠组亦形成肉芽组织，创面有所减小，生物活性玻璃粉末组创面也明显减少，并有肉芽组织生成，空白对照组有部分肉芽组织生成。10 d时，抑菌促愈合敷料组新生上皮组织已大部分覆盖创面，海藻酸钠组创面明显减小，生物活性玻璃粉末组创面愈合速度超过海藻酸钠组，空白对照组创面减小不明显。12 d时，抑菌促愈合敷料组新生上皮组织已完全覆盖创面，伤口完全愈合，海藻酸钠组创面减小但未完全愈合，生物活性玻璃粉末组亦未完全愈合，空白对照组有肉芽组织形成，创面有一定减小。

图5 糖尿病大鼠术后各时间点创面愈合情况Fig.5 The wound healing of diabetic rats at different time points

从创面愈合时间(图6)可以看出，抑菌促愈合敷料组平均愈合时间为(11.2±0.5)d，海藻酸钠敷料组为(16.1±0.67)d，生物活性玻璃粉末组为(15±0.5)d，空白对照组为(20.5±1.2)d，且抑菌促愈合敷料组与空白对照组相比有显著性差异(p<0.05)，抑菌促愈合敷料组愈合时间明显短于海藻酸钠敷料组、生物活性玻璃粉末组及空白对照组(p<0.05)。

从创面愈合率(图7)来看，同一时相点抑菌促愈合敷料的愈合率明显高于海藻酸钠敷料组、生物活性玻璃粉末组和空白对照组(p<0.05)，愈合较快。

*表示p<0.05 vs 空白对照组, #表示p<0.05 vs 海藻酸钠敷料组, ^表示p<0.05 vs 生物活性玻璃粉末组图6 各组创面的愈合时间Fig.6 Healing time of wounds in each group

#表示p<0.05 vs 空白对照组, *表示p<0.05 vs 海藻酸钠敷料组, ^表示p<0.05 vs 生物活性玻璃粉末组图7 各组创面各时相点的创面愈合率Fig.7 Wound healing rate of each group at different time points

3 结论

1)壳聚糖具有较强的吸水率和保水率，聚乙烯醇的透水汽性良好，在m(CS)︰m(PVA)为4︰6时透水汽率达到2 460 g/(m2·d)，最为接近医用敷料的理想值2 500 g/(m2·d)，同时，吸水率和保水率分别达到了23.70%和8.10%，能够吸收伤口渗液并伤口保持湿润。

2)抑菌促愈合敷料具有较好的抑菌性，随浸提液浓度的增加抑菌性增强。其中，抑菌性从大到小的顺序为：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌。

3)高糖高脂喂食SD大鼠4周后腹腔注射STZ能够使大鼠血糖急剧升高，体重减少，出现“三多一少”的症状。大鼠的脏器系数也会发生变化，尤以胸腺系数变化最为明显。

4)抑菌促愈合敷料能够促进糖尿病大鼠皮肤创面的愈合，平均愈合时间为(11.2±0.5)d。愈合时间明显少于市售海藻酸钠敷料组、生物活性玻璃粉末组和空白对照组。

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Preparation of antibacterial dressing for diabetic wound and evaluation of its perfortmance of promoting healing

GAO Cengceng, WANG Fuping, LIANG Min, MENG Xin, CHEN Zhongmin

(Pharmaceutical and Biological Engineering Colleage, Chongqing University of Technology, Chongqing 400054, China)

It is hard for diabetic wounds to heal. For this problem, silk fibroin (SF), chitosan (CS), bioactive glass (BG) and polyvinyl alcohol (PVA) were used as raw materials, and repeated freezing-thawing method was employed to prepare antimicrobial wound healing dressing. Its performance was characterized by determining the water absorption, retention rate, water vapor permeability and antibacterial properties. In addition, the diabetic skin wound model of SD rats was established. The wound healing time and wound healing rate were studied, and the effect of the wound dressing on the healing of diabetic skin was discussed. The results show that the wound dressing could accelerate the wound healing and promote the growth of granulation tissue, compared with the commercially available alginate dressing, bioactive glass and medical gauze.

diabetes; wounds; antimicrobial wound dressing; silk fibroin; wound healing; performance evaluation

10.3969/j.issn.1001-7003.2017.03.003

2016-09-06;

2016-12-28

重庆市社会民生科技创新项目(cstc2016shmszx 0635)