陈涛+林寅+雷正波+张安铎+吴亮+阳小飞+陈恒玲

摘要：在小鼠的神经母瘤细胞（N2a细胞）中观察了铜离子对细胞生长分化的影响。在N2a细胞生长发育的过程中，于培养基中加入不同浓度的铜离子，对细胞进行了成像。采集不同生长时期的细胞分化率、分支数和分支长三个指标进行了测算、分析。结果表明：在N2a细胞加入梯度浓度的铜离子后，除在加入24 h对细胞的分支长略有抑制作用外，铜离子对神经细胞的生长和分化并无显著影响。

关键词：神经细胞分化；铜离子； 突触形成； N2a细胞

1 引言

作为生物体最复杂的系统，神经系统负责生物体各种信息的传递。神经系统的信息传递通过神经突触释放神经递质而实现。研究突触的形成和调节机制，是理解神经系统各种工作机制的基础。研究学习、记忆的过程，其实就是研究学习、记忆中相关神经突触形成和调节的过程[1～3]。重大神经退行性疾病如老年痴呆症、帕金森综合症等疾病也已被证明与神经突触的非正常损伤、退化密切相关，研究突触的形成和调节机制，是治疗这些疾病的前提和依据[4～7]。

铜是细胞生长的一种必须的微量元素，它以辅基的形式参与细胞内的多种代谢途径。细胞内铜离子的变化具有广泛的影响，细胞内铜离子的浓度过低会影响细胞内一些酶的活性及相应的生理代谢途径进而影响细胞的正常功能和存活。据相关研究显示，成年人体内铜离子总量约为100～150 mg，婴幼儿每天铜摄入量约为0.4～1.0 mg，成年人每天铜摄入量约为1.5～3 mg，血清铜的正常值约10～20 μmol/L，在脑脊液中浓度更低。虽然是生理上必须的金属离子，但当铜离子的浓度超过生理需求时亦会引起严重的问题[8～10]。

为了探索铜离子对神经细胞生长分化的具体影响，实验选用小鼠的神经瘤细胞（N2a细胞）作为实验对象，在其生长的培养基中加入不同浓度的铜离子，通过对不同生长时期的细胞进行成像，测算细胞分化率、分支数和分支长并对测算结果进行统计学分析。结果发现除铜离子在较低浓度下对神经细胞的生长和分化并无特别显著的影响，显示神经细胞对低浓度的铜离子具有一定的耐受能力。

2 材料与方法

2.1 材料

实验所用N2a细胞，均系武汉大学生命科学学院周严实验室赠送，并于37 ℃，5%CO2条件下培养，约每36～48 h传代一次。

2.2 实验仪器与试剂

实验中细胞培养所用的恒温二氧化碳培养箱系由美国Thermo Fisher公司生产，细胞传代及转染所用的超净工作台由苏州净化设备有限公司生产，离心机由美国Thermo Fisher公司生产，恒温水浴锅由巩义市予华仪器有限公司生产，涡旋振荡器由其林贝尔仪器制造有限公司，免疫荧光共聚焦显微镜（Nikon Texas eclipse Ti）由日本尼康株式会社生产。

实验所需生化试剂均由美国Gibco公司生产，所有无机试剂均由美国Sigma-Aldrich公司生产。

2.3 方法

2.3.1 实验溶液配制

利用胎牛血清、DMEM等试剂配制实验所需的细胞培养基及相关缓冲液。所有溶液均需调整pH值及渗透压至适宜细胞生长和实验进行的值，并除菌。配置四个浓度梯度的氯化铜溶液，使铜离子工作浓度分别为0.0002 mg/mL、0.001 mg/mL、0.005 mg/mL、0.02 mg/mL。

2.3.2 细胞传代，准备生长密度合适的N2a细胞

以T25培养瓶为容器对细胞进行培养，以80%的覆盖率作为细胞是否传代的临界点，当细胞的覆盖率大于80%时对细胞进行传代。传代时，先清除培养基，之后取2 mL PBS缓冲液轻柔地对细胞进行清洗，以清洗细胞生长过程中的各种分泌物和残留的培养基，上述工作重复2次。之后加入1 mL 0.05%的胰蛋白酶-EDTA溶液，放入二氧化碳培養箱消化约2 min，当轻摇培养瓶可见细胞从培养瓶壁上滑落即可停止消化。加入3倍体积的细胞培养基终止消化，并轻轻将尚未从培养瓶壁上脱落的细胞吹打下来。将上述细胞悬浊液转移至15 mL离心管中，以300～400 g离心2 min。去除离心后的上清液后加入新的培养基轻柔地将细胞重悬，按比例种植到6孔板中，放入细胞培养箱中培养。

2.3.3 加入不同浓度的铜离子溶液并经行细胞成像

在移植约12 h后，细胞密度基本保持50%～80%，分别在6孔板中设置空白对照组，0.0002 mg/mL、0.001 mg/mL、0.005 mg/mL、0.02 mg/mL四个浓度梯度的铜离子加药组，及两个备用组。分别在加入不同浓度梯度铜离子后的24 h、48 h对神经细胞进行成像。

2.3.4 数据的采集与处理

统计各组神经细胞的分化率和分支长，利用Image J （National Institutes of Health）采集神经细胞的分支长，将突起总长度大于细胞胞体直径2倍的细胞视作分化细胞。以上所得数据以随机区组设计方式，用SPSS Statistic 23 （IBM Corporation）进行t检验，利用GraphPad Prism 6 （GraphPad Software， Inc）及Adobe Illustrator CC （Adobe Corporation）进行统计图绘制。

3 结果

3.1 加入Cu2+24 h后对N2a细胞生长分化的影响

根据有关文献报道，Cu2+是人体所需的元素之一，但当其含量过高亦会产生不良影响。为探究Cu2+对神经细胞生长分化的影响，选取N2a细胞作为研究对象，培养约12 h后使细胞密度基本保持50%～80%，加入Cu2+浓度分别为0.0002 mg/mL、0.001 mg/mL、0.005 mg/mL、0.02 mg/mL的CuCl2溶液。分别在培养24 h后对细胞进行成像，采集细胞的分化率和分支数，并以Image J软件测量细胞的分支长，依照随机区组方式进行数据的统计分析，在对三次独立重复实验进行了统计学分析（图1）。

在N2a細胞生长的培养基中加入梯度浓度的CuCl2溶液，培养24 h后对细胞成像发现，浓度为0.02 mg/mL 的Cu2+使细胞的分支长略有减少。除此之外，梯度浓度的Cu2+对神经细胞的生长和分化并未产生显著影响。0.02 mg/mL的Cu2+浓度已经远超过血清中正常的Cu2+浓度，因此过高浓度的Cu2+对神经细胞的分化呈抑制作用。

3.2 加入Cu2+48 h后对N2a细胞生长分化的影响

高浓度的Cu2+作用于神经细胞24 h即对分化产生一定的抑制作用，为继续研究更长时间的Cu2+作用对神经细胞的影响，加入Cu2+浓度分别为0.0002 mg/mL、0.001 mg/mL、0.005 mg/mL、0.02 mg/mL的CuCl2溶液48 h后，分别对细胞进行成像，采集细胞的分化率和分支数，并以Image J软件测量细胞的分支长，依照随机区组方式进行数据的统计分析，再对三次独立重复实验进行了统计学分析（图2）。

在N2a细胞生长的培养基中加入梯度浓度的CuCl2溶液，培养48 h后对细胞成像发现，梯度浓度的Cu2+对神经细胞的分化率、分支数和分支长均无显著影响。这一结果说明Cu2+虽然对神经细胞的分化有一定的抑制作用，但这个作用主要存在于分化的早期，随着分化时间的延长，神经细胞仍能达到正常的分化水平。

4 讨论

作为神经系统实现功能的重要事件，神经细胞分化是受众多因素影响的复杂过程，同时也是神经科学需要研究和阐明的重要问题。细胞内的多种代谢途径中，铜离子以辅基的形式存在其中，其浓度可以影响正常生理功能的维持。铜离子是人体所必须的金属离子之一，此次研究重点探讨了铜离子对神经细胞分化的影响。

研究选择N2a细胞作为实验材料。N2a细胞，即mouse neuroblastoma N2a cells，别名Neuro-2a，是由Klebe和Ruddle经A株白鼠的自生肿瘤建立，该细胞贴壁良好，多数成神经元样，具有轴突样结构。N2a细胞常见易得，且易于培养，在神经细胞的分化神经信号通路的研究中已被大量应用[11，12]。

通过在N2a细胞生长的培养基中加入梯度浓度的Cu2+离子，通过采集神经细胞分化率、分支数和分支长3个指标的数据，来研究不同浓度的Cu2+离子对神经细胞分化的影响。对所采集到的数据进行通风机学分析后发现，除在高浓度Cu2+离子（0.02 mg/mL）在加入初期（24 h）对神经细胞的分支长略有抑制作用外，不同梯度浓度的Cu2+离子对于神经细胞的生长和分化均无显著的影响。根据实验结果推测，神经细胞对Cu2+离子具有一定的耐受能力，在相对较低的浓度下，Cu2+离子不会影响神经细胞的生长和分化。但是过高浓度的Cu2+会降低细胞分化初期的分化能力。

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Influence of Copper Ionon N2a Cells Growth and Differentiation

Chen Tao，Lin Yin， Lei Zhengbo，Zhang Anduo，Wu Liang，Yang Xiaofei， Chen Hengling

（Key Laboratory of Cognitive Science， Key Laboratory of Medical Information Analysis and

Tumor Diagnosis and Treatment， Laboratory of Membrane Ion Channels and Medicine，

College of Biomedical Engineering， South-Central University for Nationalities， Wuhan，Hubei 430074， China）

Abstract： To investigate the influence of copper ion on the growth and differentiation in the mouses Neuroblastoma （N2a） cells， we addeddifferent concentrations of copper ion in the growth medium ofN2a cells. After calculating differentiation ratio， branches number and length of branches of N2a cells fromthe images of treated cells， Results show that different concentrations of copper ion had no significant effect on the growth and differentiation of N2a Cells， which expected a slightinhibition effect on length of branches after 24-hour treatment.

Key words： nerve cell differentiation；copper ion；synapse formation； N2a cells