陈竞适++刘静++任海姣++侯爱香

摘 要：为筛选肉源高产脂肪酶菌株，本研究以湘西陈年腊肉为样品，采用稀释平板计数法分析湘西腊肉的微生物结构，利用产脂肪菌株在罗丹明B筛选平板上形成变色圈的方法进行初筛，采用对硝基苯酚棕榈酸酯比色法比较初筛菌株脂肪酶活力进行复筛，通过形态学和分子生物学相结合的方法鉴定复筛菌株。结果表明：湘西陈年腊肉有丰富的微生物群落，是产脂肪酶菌株的良好菌源，酵母菌、霉菌和微球菌是其主要微生物群落；腊肉中的微生物经罗丹明B平板初筛后得1号菌株，变色圈最大为2.6 cm，11、12号菌株次之，为2.4 cm；复筛得酶活力最高的菌株为1号菌株达13.8 U/mL，与初筛预测结果一致，经构建其16S rDNA区域系统发育树，鉴定1号目的菌株为寡养单胞菌属。

关键词：腊肉；微生物菌群；平板水解圈法；酶活力测定；高产脂肪酶细菌

Microbial Flora Analysis of Aged Cured Pork in Western Hunan Province and Screening of

a High-Yield Lipase-Producing Strain

CHEN Jingshi1， LIU Jing1， REN Haijiao1， HOU Aixiang1，2，*

（1.College of Food Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China；

2.Hunan Provincial Engineering and Technology Research Center for Fermented Food， Changsha 410128， China）

Abstract： To screen a high-yield lipase strain derived from processed meat， the bacterial community structure in aged cured pork in western Hunan province was analyzed by the dilution plate count method and the isolated strains were subjected to two rounds of screening on rhodamine B plates for lipase activity. Lipase activity was colorimetrically determined using p-NPP as a substrate. The screened isolates were identified by morphology and molecular biology techniques. The results showed that abundant microbial communities existed in aged cured pork in western Hunan province， which was a good source of microbial lipase with yeasts， molds and Micrococcus being predominant. Primary screening indicated that strain 1 produced the largest zones （2.6 cm diameter） of discoloration on rhodamine B plates， followed by strains 11 and 12 （2.4 cm）. Secondary screening confirmed strain 1 to have the highest lipase activity of 13.8 U/mL. At last a phylogenetic tree was built for the screened strain to identify it as Stenotrophomonas sp.

Key words： cured pork； microbial flora； plate hydrolysis circle method； enzyme activity assay； high-yield lipase-producing bacteria

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201703001

中圖分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2017）03-0001-06

引文格式：

陈竞适， 刘静， 任海姣， 等. 湘西陈年腊肉微生物群落分析及高产脂肪酶细菌的筛选[J]. 肉类研究， 2017， 31（3）： 1-6. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201703001. http：//www.rlyj.pub

CHEN Jingshi， LIU Jing， REN Haijiao， et al. Microbial flora analysis of aged cured pork in western hunan province and screening of a high-yield lipase-producing strain[J]. Meat Research， 2017， 31（3）： 1-6. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201703001. http：//www.rlyj.pub

我国发酵肉制品有着悠久的历史，因其颜色、香气、味道和造型独特而著称于世。湖南是全国肉类食品生产大省之一，80%以上是传统腌腊制品，其中又以湘西腊肉最具有代表性，湘西腊肉主要是指在湖南西部地区的农户在腊月期间将自家喂养的本地猪宰杀，在大缸中加入食盐、糖、亚硝酸钠及多种香料进行腌制，并在自家柴火或土炉进行烟熏而加工成的传统肉制品[1]。由于高盐、低水分含量和烟熏的原因，传统腊肉的保存时间较长，一般可达8～10 个月[2]。在腊肉的发酵过程中，食盐渗透慢，生产周期较长，微生物对腊肉的风味产生了很大的影响。有研究[3]表明，腊肉中微生物可以通过代谢支链氨基酸（branched chain amino acid，BCAA）生成支链醛、醇、酸，从而形成干腌风味，同时，随着生产周期的延长，微生物的生长繁殖也逐渐增多，增加了腊肉制品的安全风险[4]。湖南传统腊肉的优势菌主要是乳酸菌和葡萄球菌[5]；葡萄球菌和乳酸菌的数量分别

为106 CFU/g和105 CFU/g[6]。

脂肪酶属于界面水解酶，在动植物体和微生物中普遍存在，可以催化三脂酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类逆向合成，广泛应用于洗涤剂、化妆品、油脂与食品加工、有机合成、表面清洗、皮革与造纸工业等生产实践领域[7]。其中微生物脂肪酶因其来源广泛，具有更好的温度以及酸碱度适应性而在食品工业被广泛应用[8]。目前对微生物脂肪酶的研究较多，但主要集中于细菌、根霉属、曲霉属、青霉属、毛霉属、地霉属、假丝酵母属、假单胞菌属、伯克霍尔德菌属等[9]，少有关于肉源中对于高产脂肪酶细菌的鉴定研究。随着猪油逐渐退出食用油市场，对猪油的利用慢慢减少，造成猪油资源的浪费，高产脂肪酶菌株的筛选与研究可以为动物油脂的改性和腌腊制品的风味改良提供新途径。

本实验以湖南腊肉为原料，对其所含的微生物种类及其数量进行鉴定和计数，分析其菌群组成，然后从中筛选出含高产脂肪酶的细菌，并进行菌种鉴定，旨在为腊肉风味改进提供微生物种类方面的意见，并对腊肉中的微生物进行合理利用，丰富高产脂肪酶微生物的可选择种类。

1 材料与方法

1.1 材料與试剂

湖南湘西腊肉 花垣县和凤凰县农户。

NaCl、4-硝基酚、阿拉伯树胶、聚乙烯醇、葡萄糖、牛肉浸膏、玫瑰红B 国药集团化学试剂有限公司；

氯霉素、Triton X-100、细菌基因组DNA提取试剂盒 北京鼎国生物技术有限公司；平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基、甘露醇高盐琼脂（manitol salt agar，MSA）培养基、MRS培养基、马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基、计数琼脂粉、酵母提取粉、细菌学蛋白胨 广东环凯微生物科技有限

公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠 天津市密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SPX-25085-Ⅱ细菌生化培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；MJX-250B-Z霉菌生化培养箱 上海博迅实业有限公司；净化工作台 蚌埠市瑞风净化设备有限公司；D2S2-LJC080鼓风干燥箱 上海福玛实验设备有限公司；XMTD-7000数显恒温水浴锅 上海浦东物理光学仪器厂；DYCP-33B型琼脂糖水平电泳槽 上海精科实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培养基及试剂的配制[9]

富集培养基：胰蛋白胨粉5.0 g、酵母提取粉2.5 g、葡萄糖1.0 g、水1 L、猪油乳化液10 L，pH 7.0；初筛培养基：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取粉5.0 g、NaCl 10.0 g、琼脂12.0 g、猪油乳化液10 mL、0.01 g/mL罗丹明B

1 mL；复筛培养基：蛋白胨4.0 g、酵母粉0.5 g、蔗糖0.5 g、（NH4）2SO4 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、KH2PO4 0.1 g、猪油乳化液4 mL、pH 8.0；Tris-HCl：6.055 g Tris碱定容至1 L，pH 7.0；对硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）溶液母液：0.139 1 g p-NP溶于200 mL Tris-HCl，pH7.0；对硝基苯酚棕榈酸酯（p-nitrophenol palmitate，p-NPP）：0.037 8 g p-NPP、0.1 g阿拉伯胶、0.4 mL Triton X-100溶于Tris-HCl缓冲液定容于100 mL，放置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 微生物计数

细菌总数按GB/T 4789.2—2010《食品微生物学检验 菌落总数测定》进行测定；酵母菌、霉菌按GB 4789.15—2010《食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》进行测定；乳酸菌按GB 4789.35—2010《食品微生物学检验 乳酸菌检验》进行测定；微球菌参考菌落总数的测定方法，通过涂布平板接种法接种于MSA培养基中进行测定；耐热菌测定时先将装有混合液的锥形瓶放入75 ℃水浴锅中加热处理，之后参考菌落总数的测定方法进行测定。

1.3.3 高产脂肪酶菌种的筛选与分离

1.3.3.1 菌株的富集培养

称取10.0 g腊肉加入到90 mL富集培养基中，置于37 ℃的摇床内以200 r/min摇床培养48 h。

1.3.3.2 菌株的初筛及纯化培养

参照黄斌[9]与洪琨[10]等的方法，将富集培养液用无菌生理盐水进行梯度稀释，各取0.1 mL 10-6、10-7和10-8

3 个梯度的稀释液涂布于含有罗丹明B的初筛培养基上，置于37 ℃条件下培养3 d后，于380 nm紫外光下观察，挑选菌落周围有明显黄色荧光圈的菌落，利用平板划线法接种到新的初筛平板上，同样条件下培养2 d，挑取有黄色荧光圈的单菌落接种于复筛培养基中，置于37 ℃条件下以200 r/min摇床培养24 h后，进行酶活力的测定。

1.3.4 脂肪酶活力的测定[9]

采用p-NPP比色法进行脂肪酶酶活力的测定。

1.3.4.1 对硝基苯酚（p-NP）标准曲线的绘制

用5 mmol/L的p-NP母液分别配制成10， 20，…， 80， 90， 100 μmol/L 10 个不同浓度的工作液，分别取各浓度的p-NP溶液在410 nm波长处测其吸光度，并用蒸馏水进行空白对照。以A410 nm为纵坐标，p-NP的浓度为横坐标，得到p-NP的标准曲线。

1.3.4.2 样品酶活力的测定[9]

取5 mmoL/L p-NPP溶液0.3 mL，待测菌菌液0.2 mL，两者充分混合后在37 ℃条件下，以200 r/min摇床培养15 min，立即取出加入0.5 mL无水乙醇终止反应。以置于80 ℃水浴锅中加热5 min进行灭活处理后的酶液为对照，以只加入0.3 mL 5 mmoL/L p-NPP溶液与0.5 mL无水乙醇为空白组。各组分别取200 μL反应液加入

96孔板中用酶标仪测定水解产生的对硝基苯酚在410 nm波长处的吸光度，根据p-NP标准曲线计算p-NP的浓度c，

并换算成酶活力单位，一个酶活力单位定义为：在37 ℃、pH 7.0条件下，每分钟水解生成1 μmol p-NP所需的酶量。

1.3.5 高产脂肪酶目的菌株的鉴定

通过对待测菌株进行初步分离筛选、摇瓶复筛、酶活力测定后，选定酶活力最高的目的菌株进行菌种鉴定。

1.3.5.1 菌落形态观察

分别用平板划线法和斜面划线法将目的菌株接种于初筛平板、PCA平板和PCA斜面培养基上，置于37 ℃恒温箱中培养2 d，观察记录菌落形态。

1.3.5.2 菌株形态观察

将PCA斜面培养基上的菌种采用革兰氏染色法进行镜检，在显微镜下直接观察菌株的形态特征。

1.3.5.3 菌株的16S rDNA分子鉴定

基因组DNA的提取：选用细菌基因组DNA提取试剂盒，参照其方法提取出基因组DNA，将提取出的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳验证，观察是否提取出基因组DNA。

16S rDNA系统发育树分析：提取细菌总DNA，将DNA送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行碱基测序，然后将得到的16S rDNA测序结果提交到美国国立生物技术信息中心（The National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库并进行BLAST对比，找到并下载典型的菌株序列与实验菌株的序列用Lasergene软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 腊肉中菌相组成及数量

由表1可知，细菌和酵母菌、霉菌数量最多，为本实验所用腊肉材料中的优势菌，微球菌、葡萄球菌和乳酸菌数量也较多，耐热菌的数量最少，其中细菌、霉菌成为优势菌可能是因为作坊式加工的湘西腊肉在其保藏上存在缺陷，沒有避免高湿的环境，导致了霉菌的大量增生，可以通过在贮藏过程中保持较低的水分活度和较低的温度或是低氧等手段避免腊肉的霉变，从而延长其保存期。

2.2 腊肉中高产脂肪酶细菌的筛选

2.2.1 高产脂肪酶菌株初筛结果

通过采用罗丹明B培养基筛选出12 株可在其中形成明显黄色透明圈的菌株，测定其菌落大小以及透明圈大小，结果如表2所示。

一般情况下，透明圈大的菌株产酶能力也会越大。由表2可知，1号菌株透明圈直径为2.6 cm，为12 组菌株中透明圈直径最大，4号菌株水解圈直径最小，仅为1.4 cm，实验组中有一半菌株的透明圈直径基本保持在2.0～2.4 cm左右。但不能仅由透明圈直径对产酶能力进行判断，因为1号菌株虽然透明圈直径大，但是其菌落直径也为最大，不能真实反映细菌的产酶能力强弱，因此需要进行进一步的酶活力测定来验证初筛的初步判断，初筛结果可以作为酶活力测定的参考结果。

2.2.2 产脂肪酶菌株复筛及酶活测定结果

采用p-NPP比色法对初筛得到的12 株待测菌株的酶活力进行检验复筛。由研究可得，p-NP浓度与吸光度的标准曲线方程为：y=0.006x+0.056 4，相关系数R2=0.997 9，相关性较好，可以根据该方程用吸光度来判断p-NP的浓度。利用酶标仪测定所得结果为p-NP的吸光度，根据已测得的p-NP浓度与吸光度的标准曲线，得到各组菌株所对应的p-NP浓度，换算成酶活力大小如表3所示。

由表3可知，通过比较分析，可以得出12 组菌株中，1号菌株的酶活力最高，达13.8 U/mL，10号次之，

2号最低仅为1.4 U/mL。1号组的酶活力约为2号组酶活力的9.8 倍，其余普通产脂肪酶菌株酶活力基本在

5～6 U/mL之间，为高产菌株的1/2，由酶活力测定结果结合初筛结果可知：初筛利用透明圈和菌落直径对产酶能力进行预测，仅为参考意见，表观特征可能受环境条件等其他因素的影响，而酶活力测定是在同等条件下从酶解产物浓度对产酶能力进行判断，比初筛结果更为可靠。由酶活力大小可知，1号菌株因其产酶能力较强，宜作为目的菌株进行研究。

2.3 腊肉中高产脂肪酶菌株的鉴定

2.3.1 菌种的形态观察

将1号菌种接种于罗丹明B培养基，在37 ℃条件下培养（48±2） h后形成明显的透明圈，菌落形态呈不规则状，边缘为锯齿状，表面较黏稠，有菌膜。

2.3.2 菌种的形态观察结果

对目的菌株进行革兰氏染色，在普通光学显微镜下放大100 倍，观察个体形态，如图1所示。

由图1可知，目的菌株1号菌经革兰氏染色后呈红色，为革兰氏阴性菌。细菌呈直杆状，两端钝圆，长度较短，为短杆菌。

2.3.3 目的菌株的16S rDNA分子鉴定结果

2.3.3.1 基因组DNA的提取结果

将基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳，得到电泳条带如图2所示，说明基因组DNA已被提取。

2.3.3.2 目标菌株的碱基测序结果

将DNA提取物送交生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，得到1号细菌的1 447 个碱基序列，其基因碱基测序结果如下：

2.3.3.3 系统发育树的构建结果

根据16S rDNA测序结果，将得到的碱基序列在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/上进行BLAST比对，结果见表4。

由图3可知，发育树结果可判定1号菌株为寡养单胞菌（Stenotrophomonas sp.）。

3 讨 论

3.1 腊肉中菌相和优势菌的分析及应用

腊肉中的微生物种类及数量对腊肉的发酵和呈味作用有着较大的影响[11]，为了优化腊肉发酵工艺、改善腊肉风味，国内外已有多位学者对其进行了研究，如陈美春等[12]对四川腊肉在腌制和贮存过程中微生物的变化情况进行了研究，发现在腌制中期乳酸菌为最主要的优势菌，其次为葡萄球菌，乳酸菌数1.0×105 CFU/g，葡萄球菌数4.3×104 CFU/g，在成熟贮藏过程中，腊肉中各菌群的数量不断变化，霉菌和酵母菌继续生长。刘洋[13]通过对2 种腊肉产品中的葡萄球菌和芽抱杆菌分离鉴定发现，传统腊肉中优势菌株为肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；低盐腊肉中的葡萄球菌和芽孢杆菌构成复杂，没有明显的优势菌株。通过对腊肉的菌相进行分析，可以为腊肉的风味改良[14]

提供一定的思路，现大多数研究主要集中在腊肉的添加物或是腊肉自身所含化学物质的变化对其风味的影响，如在腊肉中添加木瓜蛋白酶[15]、胰蛋白酶[16]，以及腊肉加工过程中脂肪氧化分解与呈味作用之间的关系[17]，而少有从微生物组成角度对风味进行研究的实验。在对腊肉进行菌相分析时，本实验结果表明，优势菌株主要为酵母菌、霉菌、微球菌，霉菌成为优势菌可能是湖南腊肉风味的重要组成因素，也可能是贮藏过程中水分含量较高而腊肉品种为陈年腊肉，存放时间过长，导致霉菌大量生长成为优势菌[18]。可以认为，腊肉中的优势菌除了受腊肉本身的影响外，还可能与环境条件、地域和存放时间有关，因此在菌相组成上与其他地区的腊肉有些许差异[19]。本实验对湖南陈年腊肉微生物菌群进行了研究，并对其中的高产脂肪酶菌株进行了筛选，可以对湖南地区陈年腊肉的防腐措施[20]提供建议，并对发酵菌株的选育提供一定的指导，有利于指导湖南特色风味腊肉发酵剂的研发，从而进行工业化大规模生产。微生物发酵剂的应用有利于缩短发酵时间，降低生产成本，控制产品品质，生产中一般用乳酸菌与微球菌或霉菌或酵母的混合菌种进行发酵[21]，如刘洋等[22]通过实验发现，以戊糖片球菌、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、清酒乳杆菌和汉逊德巴利酵母菌组合微生物发酵剂SM-194对四川腊肉的理化及微生物特性有显著影响，可在一定程度上改善产品品质，保障產品的安全性。

3.2 腊肉中高产脂肪酶的筛选和鉴定

以前的研究大多集中在动植物中，如从萌发的油菜种子中制备脂肪酶[23]。细菌和真菌中脂肪酶的发现，带动了微生物资源的发展[24]，微生物脂肪酶相较于动植物脂肪酶，具有生产成本低，产量高和繁殖速度快等特点[25]，因此在工业生产中被广泛运用，具有较高的应用价值。符小燕等[26]从广式腊肠中筛选出的葡萄球菌经诱变后酶活力为5.26 U/mL，为初始酶活力的8 倍，在特定的优化培养基中测得最高酶活力为17.54 U/mL。实验对腊肉中存在的高产脂肪酶进行了筛选分离、酶活力测定、碱基测序与定性分析，从腊肉中筛选出了实验条件下最高酶活力为13.8 U/mL的革兰氏阴性寡养单胞菌。

国内有许多学者对微生物中脂肪酶的应用进行了研究，如利用微乳凝胶固定化皱落假丝酵母脂肪酶（Candida rugosa lipases，CRL）在有机溶剂中催化戊酸和乙醇合成食品领域、化妆领域重要香味剂——戊酸乙酯[27]。张权等[28]利用壳聚糖固定化海洋微生物YS2071脂肪酶，发现脂肪酶经固定化处理之后，其酸碱耐受性增强，酶活力保留率比游离脂肪酶要高，为微生物脂肪酶的应用提供了数据基础。在生物柴油的合成方面，微生物脂肪酶也有着重要的应用。通过单因子实验发现，霉菌X-28的紫外线突变株X-281产生的脂肪酶对催化生物柴油的合成有着重要的影响。以大豆油为原料，发现在5 mL正乙烷作为溶剂，使用20%的固定化脂肪酶用量，反应温度为40 ℃，采用每5 h流加油醇-甲醇（物质的量比1∶1）3 次时，大豆油的转化率可高达91%[29]。

本研究对腊肉中高产脂肪酶菌株进行筛选、分离和鉴定，国内研究少有，同时腊肉中的高产脂肪酶对腊肉的风味以及油脂含量也有着较大的影响[30]，可以此作为改善腊肉风味的后续研究方向。经筛选得到的高产脂肪酶菌株丰富了微生物脂肪酶的种类，对其进行碱基定序和发育树定性操作，进一步确定了高产脂肪酶菌株的种属，有利于其后续的开发利用。但由于并未对筛选出来的高产酶菌株进行不同底物的反应实验，因此对于其在实际生产生活中的运用还较为局限。

4 结 论

本研究主要对腊肉中的菌相组成和数量进行了分析，并筛选鉴定出了腊肉中所含的高产脂肪酶菌株，实验结果显示：腊肉中的主要菌种为酵母菌、霉菌和微球菌，高产脂肪酶菌株为寡养单胞菌，且在实验条件下，最高酶活力可达13.8 U/mL。湖南腊肉的菌相构成对湖南腊肉的工业化生产有着一定的参考作用[31]，高产脂肪酶的发现进一步提升了腊肉中微生物的利用价值。但实验对影响腊肉风味的优势菌株并未进行研究，仅分析了种类和数目，下一步可以根据本实验结果对腊肉的微生物发酵剂配方进行研究[32]，同时对实验中筛选出来的高产脂肪酶菌株进行应用研究，观察在不同底物条件下或不同实验条件下，其产酶能力的变化，从而确定其最适底物和最适作用条件[33]，将其合理运用于实际生产。

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