人线粒体转录终止因子3在胃癌组织中的表达及其意义

自加吉1，2，杨勇琴1，2，孙美涛1，梅 雯1，于成和1，张晓娟3，熊 伟1，2

目的分析 hMTERF3 mRNA和蛋白质在胃癌组织及正常组织中的表达，探讨其与胃癌发生、发展的关系。方法分别采用半定量RT-PCR和免疫组化SP法，检测61例胃癌组织及正常组织中hMTERF3 mRNA和蛋白质表达水平，分析 hMTERF3表达与胃癌临床分期、病理分级、肌层浸润和淋巴结转移的关系。结果hMTERF3 mRNA和蛋白质在胃癌组织中的表达水平显著高于正常胃组织。hMTERF3蛋白在正常胃组织阳性率为24.6%（15／61），胃癌组织中的阳性率为86.9%（53／61），差异具有统计学意义。hMTERF3蛋白的表达与胃癌临床分期、病理分级、肌层浸润和淋巴结转移有关。结论hMTERF3蛋白的表达异常可能是胃癌发生、发展的分子机制之一，可为预测胃癌的发生提供可能的生物学标志物，也可为胃癌基因诊断和基因治疗提供潜在的靶标。

胃肿瘤；人线粒体转录终止因子3；RT-PCR；免疫组织化学

人线粒体转录终止因子3（humanmitochondrial transcription termination factor 3，hMTERF3）属于负调控线粒体 DNA （mitochondrial DNA，mtDNA）基因表达的蛋白因子，主要参与 mtDNA的转录抑制、DNA复制及拷贝数的调节［1］。最近研究表明，hMTERF3蛋白还能调节线粒体中核糖体大亚基的组装，影响线粒体核糖体的生成，进而影响细胞的能量代谢［2］。肿瘤的发生、发展并不仅仅依赖于细胞核内的遗传物质，也与线粒体基因有一定的关联［3］。目前，已有文献报道肝癌、胃癌、肾癌和结肠癌等多种实体瘤及肿瘤细胞株中mtDNA突变率增高、mtDNA拷贝量减少和线粒体呼吸链酶活性降低［4］，提示肿瘤中参与线粒体基因表达调控的蛋白因子可能存在表达异常。胃癌是世界范围内常见的消化道恶性肿瘤之一，每年有近 951 000例的新发病例和 723 000例的死亡病例，且有年轻化的趋势，病死率高，危害性大［5］。胃癌的发生是一个多步骤、多因素参与的复杂过程，其中涉及多种复杂的机制和信号转导的变化［6］；探讨胃癌发生、发展和转移机制，寻找可能的预测指标，对检测胃癌病程进展、转移潜能及预后估计具有重要的意义。目前，胃癌组织中hMTERF3的表达变化尚未见文献报道。本文采用半定量RT-PCR和免疫组化SP法检测正常胃组织和胃癌组织中hMTERF3的表达水平，分析其在胃癌中的表达规律以及与生物学行为特性之间的关系，以期探讨 hMTERF3与胃癌发生、发展的关系。

1 材料与方法

1.1 材料收集大理州人民医院和大理市第一人民医院消化内科2015年1～12月胃癌标本61例，其中男性35例，女性26例。中位年龄52.3岁，低分化腺30例，中分化腺癌18例，高分化腺癌13例；32例有淋巴结转移，29例无淋巴结转移；浸润至浆膜层者39例，浸润至肌层者22例；根据2010年国际抗癌联盟／美国癌症联合委员会（UICC／AJCC）TNM分期标准：Ⅰ＋Ⅱ期 21例，Ⅲ＋Ⅳ期 40例。所有采集的标本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，常规方法制备病理切片，每例标本同时取距离胃癌组织约 5 cm外的正常胃组织作对照。所有入选病例术前均未接受放、化疗，全部病例均经组织病理学证实，临床病理资料完整。本实验经大理大学医学研究伦理委员会批准。

1.2 试剂兔抗 hMTERF3多克隆抗体购自美国 Abcam公司；生物素标记的二抗 IgG购自北京鼎国昌盛公司；免疫组化 SP染色试剂盒、DAB染色试剂盒购自北京中杉金桥公司；PBS缓冲液（0.01 mmol／L，pH 7.4）购自上海碧云天公司；核酸分子量标准 DL2000、Trizol RNA提取试剂盒、One Step RNA PCR Kit（AMV）Ver 3.0购自大连宝生物公司；核酸染料 DuRed购自北京全式金生物公司，PCR引物由昆明硕擎生物公司合成。

1.3 方法

1.3.1 半定量 RT-PCR 利用半定量 RT-PCR技术检测hMTERF3 mRNA在胃癌组织和正常胃组织中的表达。PCR引物序列采用Primer Premier6.0设计，以β-actin为内参，引物序列如下：上游5′-CAGGAAGGAAGGCTGGAAG-3′；下游5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′；扩 增 片 段 约 200 bp。hMTERF3引物序列如下：上游5′-ACTTACAGGACTTCCTCCTTATG-3；下游5′-GTCTTCAGAGAAAATTGCAT-3′；扩增片段约 450 bp。逆转录反应体系 20μL，PCR反应体系为 25 μL，循环条件如下：95℃预变性 5 min后进入循环，每个循环为95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循环28次，最后72℃延伸5 min，4℃保存。取5μL PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳，120 V，50 min，核酸染料 DuRed显色。采用DL2000 DNA Maker作为分子量对照。紫外分光光度仪下观察，凝胶成像系统采集图像，Quantity One v 4.6.2软件扫描产物灰度值，以 hMTERF3基因的 PCR扩增片段灰度值与内参基因的 PCR扩增片段灰度值的比值作为其 mRNA表达水平的半定量参数。

1.3.2 免疫组化 采用免疫组化 SP法检测胃癌组织和正常胃组织中 hMTERF3的表达。手术切除的组织经 10%中性福尔马林固定后，石蜡包埋，4μm厚切片，枸橼酸热抗原修复。一抗使用兔抗hMTERF3多克隆抗体（工作液浓度为1∶100），4℃孵育过夜。以 PBS缓冲液（0.01 mmol／L，pH 7.4）代替一抗作为阴性对照。生物素标记的二抗 IgG 37℃孵育30 min，最后以 DAB法显色。

1.3.3 判断标准 结果判断采用双盲法阅片，hMTERF3阳性表达定位于细胞质，阳性判定以染色强度及阳性细胞数综合判定。镜下随机选取5个视野，判断标准依据细胞着色强度及阳性细胞数综合进行。按标准细胞着色强度评分：不显色或显色不清为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。按显色细胞的比例评分：无显色细胞为0分，＜10%为1分，10%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75% 为4分。每例积分≤2分为阴性（－），3～4分为弱阳性（＋），5～8分为中度阳性（⧺），9～12分及以上为强阳性（⧻）。

1.4 统计学分析采用 SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，各组间数据比较依据资料的性质，采用 t检验或 ANOVA方差分析；计数资料比较使用 χ2检验。以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 hMTERF3 mRNA在正常胃组织和胃癌组织中的表达

半定量RT-PCR结果显示，hMTERF3mRNA在胃癌组织中的表达显著高于正常胃组织，差异有显著性（P＜0.05）。Quantity One v4.6.2软件扫描产物灰度值，以 hMTERF3基因的 PCR扩增片段灰度值与内参基因的 PCR扩增片段灰度值的比值作为其 mRNA表达水平的半定量参数，结果表明胃癌组织中hMTERF3 mRNA表达水平约为正常胃组织中表达水平的2.029倍（图1）。

2．2 hMTERF3蛋白在正常胃组织和胃癌组织中的表达

免疫组化结果显示，hMTERF3蛋白定位表达于细胞质，在胃癌组织中 hMTERF3蛋白表达水平明显高于正常胃组织（图2）。此外，hMTERF3蛋白在正常胃组织阳性率为 24.6%（15／61），胃癌组织中的阳性率为86.9%（53／61），hMTERF3蛋白在胃癌组织中的阳性率显著高于正常胃癌组织中的表达，且差异有显著性 （χ2＝47.976，P＝0.001，表 1）。hMTERF3蛋白的表达与患者性别及年龄无显著相关性（P＞0.05）。hMTERF3蛋白的表达与胃癌的临床分期、病理分级、肌层转移及淋巴结转移具有明显的相关性，差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。hMTERF3蛋白的表达量随组织学分级增高和浸润深度加深而增加，差异具有显著性（P＜0.05）。hMTERF3蛋白在低分化组表达量显著高于高、中分化组（χ2＝4.957，P＝0.026）；在胃癌 TNM分期的Ⅲ、Ⅳ期的表达量显著高于Ⅰ、Ⅱ期（χ2＝6.715，P＝0.010）；在淋巴结转移的病例中表达量显著高于无淋巴结转移的病例（χ2＝4.533，P＝0.033）。

图1 半定量 RT-PCR检测 hM TERF3 m RNA在正常胃组织和胃癌组织中的表达：A.电泳图；B.直方图

图2 hMTERF3蛋白的表达，SP法：A.正常胃组织；B.胃癌组织

表1 hM TERF3蛋白在胃癌组织及正常胃组织中的表达

表2 hMTERF3蛋白在胃癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系

3 讨论

糖的有氧代谢减弱而无氧酵解显著增强是肿瘤细胞能量代谢的一个共同特点，对于缺氧条件的适应是肿瘤进一步发展非常关键的步骤［7］。在大多数实体性肿瘤中，这种能量代谢的异常和 mtDNA拷贝数以及氧化磷酸化相关酶活性的降低有密切的关系［8－9］。近年来国内外学者对 m tDNA与肿瘤之间的关联提出一些假说，已有的研究资料提示肿瘤的生物学特征不仅取决于核内遗传物质，而且与核外的mtDNA有一定的关系。mtDNA是环境致癌物作用的重要靶标，其损伤程度和突变率显著高于核内 DNA。

hMTERF3是一个哺乳动物线粒体基因转录和能量代谢的负调控因子，它可结合至 mtDNA的重链和轻链启动子上的序列元件，抑制 mtDNA基因的转录水平，从而降低线粒体呼吸链酶活性和氧化磷酸化产能［10］。在前期实验中，我们成功在大肠杆菌中原核表达和纯化hMTERF3蛋白，并制备鼠抗人多克隆抗体。采用细胞免疫荧光法证实，hMTERF3定位于人胚肾 HEK293细胞线粒体中［11］。Hyvärinen等［12］用二维琼脂糖凝胶电泳法对 mtDNA复制中间体的实验发现，在人胚肾 HEK293细胞中过量表达 hMTERF3蛋白能显著抑制mtDNA复制，造成细胞内mtDNA拷贝数的下降。目前，已有文献报道胃癌组织及胃癌细胞株中mtDNA突变率增高、mtDNA含量减少和线粒体呼吸链酶活性降低［13］。提示 hMTERF3作为在肿瘤细胞中参与线粒体基因复制和转录负调控的重要蛋白因子，其表达水平可能存在异常。

近年来，肿瘤分子水平的研究成为热点，但是人们对胃癌发生、发展的分子机制仍亟待深入理解。胃癌的癌变是一个多因素、多步骤、多阶段发展过程，涉及癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因与转移相关基因等的改变，而基因改变的形式也是多种多样的［14］。胃癌发病隐匿，一经发现多数已经浸润、转移［15］。因此，找到一种早期诊断胃癌的指标具有重要意义。本实验表明，hMTERF3 mRNA和蛋白质在正常胃组织和胃癌组织中均有表达，但在胃癌组织中，hMTERF3蛋白阳性率显著高于正常胃组织，差异有统计学意义，提示hMTERF3可能参与胃癌的发生。在浸润程度较深、TNM分期较高、有淋巴结转移及分化程度较低的胃癌组织中，hMTERF3呈高表达，推测hMTERF3的过量表达与癌组织的侵袭与分化有密切的关系。同时，在已发生癌变的组织中hMTERF3可能继续参与胃癌的演进和侵袭，由于本组样本量有限，实验结果仍需大样本进一步分析证实。初步结果显示，hMTERF3可能在胃癌发生、发展中扮演重要的角色。阐明 hMTERF3在胃癌组织中的表达水平和分布情况，有利于从基因角度分析胃癌发生、侵袭及演进的机制，以进一步寻找胃癌基因诊断和基因治疗的靶标。

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R 735.2

：B

1001－7399（2017）01－0084－04

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.021

接受日期：2016－11－22

国家自然科学基金（81560458、31601155）、云南省教育厅科学研 究基 金 重点 项 目（2014Z126、2016ZDX101、2016ZDX105）、大理大学博 士科 研 启动 基 金（BSKY2012018）、大理大学大学生创新创业计划（CXCYX-2016-18）

1大理大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，大理 6710002云南省昆虫生物医药研发重点实验室，大理 6710003云南省大理市第一人民医院呼吸科，大理 671000

自加吉，男，硕士，讲师。E-mail：zjjdlxyjc＠163.com 熊 伟，男，博士，副教授，硕士生导师，通讯作者。

E-mail：791372366＠qq.com