郑 丽，赵 敏，昂 琳，黄 金，王 瑾，邹 强，吴正升

乳腺癌中BCL-6和ZEB2的表达及其意义

郑 丽1，赵 敏1，昂 琳1，黄 金1，王 瑾1，邹 强1，吴正升2

目的探讨 BCL-6和 ZEB2在乳腺癌侵袭、转移及预后中的生物学意义。方法分别采用免疫组化 SP两步法与原位杂交法检测228例乳腺癌和80例乳腺良性病变组织中BCL-6、ZEB2蛋白及mRNA的表达。结果乳腺癌组织中 BCL-6、ZEB2蛋白及 mRNA表达水平均显著高于乳腺良性病变组织（P＜0.05）；BCL-6表达与肿瘤大小、淋巴结转移、组织学分级、TNM分期及 HER-2表达均呈正相关（P＜0.05）；ZEB2表达与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期及 HER-2表达均呈正相关（P＜0.05）；乳腺癌中 BCL-6、ZEB2阳性者总生存期及无复发生存期均显著低于阴性者（P＜0.01）。结论BCL-6、ZEB2与乳腺癌演进过程密切相关，检测 BCL-6和ZEB2的表达，有望成为监测与预警乳腺癌侵袭、转移及预后的重要手段。

乳腺肿瘤；BCL-6；ZEB2；免疫组织化学；原位杂交

乳腺癌是全球范围内女性最常见的恶性肿瘤之一，肿瘤术后复发与转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因。建立有效的监测和预警乳腺癌侵袭、转移的手段，及早进行针对性干预治疗，对改善患者预后及提高患者生活质量具有十分重要的意义。肿瘤细胞上皮－间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在乳腺恶性肿瘤演进过程中发挥主要作用，多种调控因子参与EMT的发生，如ZEB1、 ZEB2、TGFβ、VEGF等。有文献报道［1］BCL-6也可促进乳腺癌细胞发生 EMT。本文分别采用免疫组化 SP两步法和原位杂交法检测乳腺癌及乳腺良性病变组织中BCL-6、ZEB2蛋白及mRNA的表达，探讨两者在乳腺癌侵袭、转移及预后中的生物学意义。

1 材料与方法

1.1 材料选取合肥市第二人民医院病理科和安徽医科大学第一附属医院病理科 2004年 5月 ～2014年11月手术切除的女性浸润性乳腺癌标本228例。患者年龄33～83岁，中位年龄58岁；根据WHO（2012）乳腺肿瘤分级标准：Ⅰ级 19例、Ⅱ级141例、Ⅲ级68例；根据国际抗癌联盟 TNM乳腺肿瘤分期标准：Ⅰ期9例、Ⅱ期110例、Ⅲ期98例、Ⅳ期 11例。患者术前均未接受过放、化疗或免疫治疗，其中197例患者具有完整的生存随访资料，中位随访时间为60个月。另收集同期手术切除的女性乳腺良性病变组织80例（其中乳腺腺病41例、乳腺纤维腺瘤33例、乳腺导管上皮普通型增生6例）；年龄16～58岁，中位年龄37岁。

1.2 试剂

1.2.1 免疫组化试剂 兔抗人多克隆抗体BCL-6（浓缩型）及鼠抗人单克隆抗体ZEB2（浓缩型）均购自美国Rockville公司。ER、PR、CerbB-2、SP免疫组化检测试剂盒及 DAB显色液等均购自上海长岛生物公司。

1.2.2 原位杂交试剂 BCL-6及ZEB2 mRNA原位杂交检测试剂盒均购自武汉博士德公司。所用地高辛标记的寡核苷酸探针序列如下，BCL-6：5′-GACAGCTGTATCCAGTTCACCCGCCATGCCAGTGA-3′，5′-TTCTATAGCATCTTTACAGACCAGTTGAAATGCA A-3′，5′-ATCCTGCAGATGGAGCATGTTGTGGACAG TTGCCG-3′；ZEB2：5′-TACTATGCTATGAACATGGA GCCCAACTCCGATGA-3′，5′-AAGGAATTTTCAAATTCAAATAATCTGGACAACAA-3′，5′-ATGAACCGGG CTTACTTGCAGAGCATTACCCCTCA-3′。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化法检测 BCL-6、ZEB2蛋白的表达

采用免疫组化 SP两步法检测BCL-6、ZEB1蛋白在乳腺癌和乳腺良性病变中的表达。BCL-6抗体使用浓度为1∶100，ZEB2抗体使用浓度为 1∶100。选用已知阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

1.3.2 原位杂交检测 BCL-6、ZEB2 mRNA表达切片经脱蜡、水化、3%过氧化氢孵育、胃蛋白酶消化等一系列处理后，滴加地高辛标记的BCL-6或ZEB2探针，40℃恒温杂交 20 h，生物素化鼠抗地高辛抗体37℃温浴1 h，链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物（SABC）孵育后DAB液显色。使用已知阳性切片作阳性对照，探针稀释液代替探针作阴性对照。

1.4 结果判定BCL-6和ZEB2蛋白染色均主要以细胞核和（或）细胞质呈棕黄色或棕褐色判定为阳性着色。BCL-6和ZEB2 mRNA染色也以细胞核和（或）细胞质呈棕黄色或棕褐色判定为阳性着色。每张切片均选取 5个400倍高倍视野，统计阳性细胞数占肿瘤细胞总数百分比：无阳性细胞或阳性细胞数＜10%，判定为阴性；阳性细胞数≥10%，判定为阳性。

1.5 统计学处理使用 SPSS 13.0软件进行统计学处理。采用χ2检验比较样本阳性率之间的差异；采用 Kaplan-Meier生存曲线法及 Log-rank检验比较组间生存率；采用非参数 Spearman等级相关检验分析阳性率与临床病理参数之间的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 BCL-6和 ZEB2在乳腺癌及乳腺良性病变中的表达

2.1.1 BCL-6和 ZEB2蛋白的表达 228例乳腺癌中125例BCL-6蛋白呈阳性，阳性率为54.8%；80例乳腺良性病变中28例BCL-6蛋白呈阳性，阳性率为35.0%。BCL-6蛋白在乳腺癌和乳腺良性病变中的表达差异有显著性（P＜0.05，表1，图1）。228例乳腺癌中 126例 ZEB2蛋白呈阳性，阳性率为55.3%；80例乳腺良性病变中26例 ZEB2蛋白呈阳性，阳性率为32.5%。ZEB2蛋白在乳腺癌和乳腺良性病变中的表达差异有显著性（P＜0.05，表1，图2）。

表1 BCL-6和 ZEB2蛋白在乳腺癌和乳腺良性病变中的表达

2.1.2 BCL-6和 ZEB2 mRNA的表达 228例乳腺癌中123例BCL-6 mRNA呈阳性，阳性率为53.9%（图3）；80例乳腺良性病变中25例BCL-6 mRNA呈阳性，阳性率为31.3%。BCL-6 mRNA在乳腺癌和乳腺良性病变中的表达差异有显著性（P＜0.05，表2）。228例乳腺癌中119例 ZEB2 mRNA呈阳性，阳性率为52.2%（图 4）；80例乳腺良性病变中26例ZEB2 mRNA呈阳性，阳性率为32.5%。ZEB2 mRNA在乳腺癌和乳腺良性病变中的表达差异有显著性（P＜0.05，表2）。

表2 BCL-6和ZEB2 mRNA在乳腺癌和乳腺良性病变中的表达

2．2 BCL-6和 ZEB2表达与乳腺癌临床病理特征及ER、PR、HER-2相关性分析乳腺癌中BCL-6蛋白表达与肿瘤大小、淋巴结转移、组织学分级、TNM分期及 HER-2表达状况均呈正相关（P＜0.05），与患者年龄及ER、PR表达状况均无相关性；ZEB2蛋白表达与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期及HER-2表达均呈正相关（P＜0.05，表3），与患者年龄、组织学分级及ER、PR表达均无相关性。

图1 BCL-6蛋白在乳腺癌中的表达，SP两步法 图2 ZEB2蛋白在乳腺癌中的表达，SP两步法 图3 BCL-6 mRNA在乳腺癌中的表达，原位杂交法 图4 ZEB2 mRNA在乳腺癌中的表达，原位杂交法

2．3 BCL-6与 ZEB2表达与乳腺癌患者生存率的关系采用Kaplan-Meier生存曲线法及Log-rank检验分析乳腺癌中 BCL-6和ZEB2蛋白表达与患者总生存率（overall survival，OS）和无复发生存率（root file system，RFS）的相关性。BCL-6蛋白阳性的乳腺癌患者 RFS和 OS均显著低于其阴性乳腺癌患者（P＝0.002，P＝0.001）。ZEB2蛋白阳性的乳腺癌患者RFS和OS亦显著低于其阴性乳腺癌患者（P＝0.003，P＝0.001，图5）。

2．4 乳腺癌中 BCL-6、ZEB2表达的相关性Spearman相关分析表明，BCL-6蛋白表达与 mRNA表达呈正相关性（r＝0.721，P＜0.01），ZEB2蛋白表 达 与 mRNA表 达 呈 正相 关性 （r＝0.747，P＜ 0.01）；BCL-6蛋白表达与 ZEB2蛋白表达呈正相关（r＝0.669，P＜0.01），BCL-6 mRNA表达与 ZEB2 mRNA表达亦呈正相关（r＝0.382，P＜0.01）。

表3 BCL-6和 ZEB2蛋白表达与乳腺癌临床病理特征的关系

3 讨论

BCL-6属于BTB／POZ转录因子家族，编码核转录抑制蛋白，主要功能是抑制细胞转录，阻止细胞分化、凋亡，促进其发育、增殖。BCL-6是淋巴系统功能调节的重要因子之一，既往研究［2－3］发现 BCL-6在生发中心B细胞和生发中心来源的 B细胞淋巴瘤中高表达。近年来有文献报道BCL-6在乳腺癌组织中也呈阳性，并与肿瘤分化、进展密切相关，在乳腺癌分子靶向治疗中可能具有潜在价值。多数文献报道［4－7］BCL-6在乳腺癌组织中高表达，随肿瘤进展而表达上调，Pinto等［8］则指出 BCL-6蛋白在乳腺癌原发灶中阳性，而在复发、转移的乳腺癌中表达缺失，与前者结论不同。本组中BCL-6在乳腺癌组织中与乳腺良性病变组织中的表达差异有显著性，乳腺癌组织中BCL-6明显高表达，与先前报道结果较一致，且 BCL-6蛋白表达与 mRNA表达呈正相关。乳腺癌中BCL-6蛋白表达与肿瘤大小、淋巴结转移、组织学分级、TNM分期和 HER-2表达均呈正相关；而肿瘤大小、淋巴结转移状况均是乳腺癌TNM分期的重要因素，TNM分期和组织学分级又与肿瘤生物学行为、预后密切相关，分级、分期越高者，肿瘤进展程度越高、预后越差；乳腺癌 HER-2阳性者，肿瘤细胞恶性程度亦更高，提示 BCL-6在乳腺癌的发生、发展中可能发挥重要作用。本实验的生存率分析结果显示，乳腺癌患者中BCL-6阳性者OS 及 RFS均显著低于 BCL-6阴性者，提示 BCL-6与乳腺癌预后密切相关。

图5 乳腺癌中 BCL-6、ZEB2蛋白的生存曲线图

A.BCL-6表达与 RFS；B.BCL-6表达与 OS；C.ZEB2表达与RFS；D.ZEB2表达与OS

ZEB2可通过与E-基因的启动子上结合，抑制E-cadherin的转录，诱导肿瘤细胞EMT的发生，从而增强 肿瘤 的 侵袭、转移 能 力［9－11］。有 研 究发 现，ZEB2在乳腺癌细胞中表达，且表达水平与E-cadherin表达呈负相关［12］；Si等［13］指出，ZEB2可通过与GATA3的循环反馈作用而抑制核转录，进一步诱导EMT的发生，促进乳腺癌转移。本组乳腺癌中ZEB2蛋白及 mRNA表达均显著高于乳腺良性病变，且乳腺癌中 ZEB2蛋白表达与 mRNA表达呈正相关，推测 ZEB2可能参与乳腺癌的发生、进展。随着肿瘤直径的增大、淋巴结转移的发生和 TNM分期的增高，ZEB2蛋白阳性率均明显增高；HER-2高表达者，ZEB2阳性率亦显著增高，进一步证实ZEB2在乳腺癌进展中的推动作用。ZEB2高表达的乳腺癌患者OS及RFS均显著降低，证实ZEB2表达与乳腺癌预后相关。

综上所述，本组结果提示BCL-6和ZEB2是乳腺癌恶性演进过中的两项重要因子，检测 BCL-6、ZEB2表达有望成为监测与预警乳腺癌侵袭、转移及预后的重要手段。此外，实验发现乳腺癌组织中BCL-6与ZEB2蛋白表达、BCL-6与ZEB2 mRNA表达均呈正相关，提示 BCL-6与 ZEB2在乳腺癌的演进过程中可能具有某种相互促进作用，但具体机制尚有待进一步分析。

［1］ Yu JM，Sun W，Hua F，etal.BCL-6 induces EMT by promoting the ZEB1-mediated transcription repression of E-cadherin in breastcancer cells［J］.Cancer Lett，2015，365（2）：190－200.

［2］ Todorovic′M，Balint B，Andjelic B，et al.Switching to BCL-6 negativity in relapsed diffuse large B cell lymphoma correlated with more aggressive disease course［J］.Indian JHematol Blood Transfus，2014，30（4）：269－274.

［3］ 陶 琨，朱雄增，徐薇苓，等.原癌基因bcl-6在淋巴组织增生性疾病中表达及意义［J］.临床与实验病理学杂志，2000，16 （2）：93－95.

［4］ Wu Q，Liu X，Yan H，et al.B-cell lymphoma 6 protein stimulates oncogenicity of human breast cancer cells［J］.BMCCancer，2014，14（1）：418－429.

［5］ Walker SR，Liu S，Xiang M，etal.The transcriptionalmodulator BCL6 as amolecular target for breast cancer therapy［J］.Oncogene，2015，34（9）：1073－1082.

［6］ Logarajah S，Hunter P，Kraman M，et al.BCL-6 is expressed in breast cancer and preventsmammary epithelial differentiation［J］. Oncogene，2003，22（36）：5572－5578.

［7］ Bos R，Van Diest P J，Van der Groep P，etal.Protein expression of B-cell lymphoma gene 6（BCL-6）in invasive breast cancer is associated with cyclin D1 and hypoxia-inducible factor-1alpha （HIF-1alpha）［J］.Oncogene，2003，22（55）：8948－8951.

［8］ Pinto A E，AndréS，Silva G，et al.BCL-6 oncoprotein in breast cancer：loss of expression in disease progression［J］.Pathobiology，2009，76（5）：235－242.

［9］ Voutsadakis I A.Epithelial-mesenchymal transition（EMT）and regulation of EMT factors by steroid nuclear receptors in breast cancer：a review and in silico investigation［J］.J Clin Med，2016，5（1）：11－33.

［10］Katoh M.Integrative genomic analyses of ZEB2：Transcriptional regulation of ZEB2 based on SMADs，ETS1，HIF1alpha，POU／OCT，and NF-kappaB［J］.Int JOncol，2009，34（6）：1737－1742.

［11］毛苡泽，王世宣.ZEB家族与肿瘤［J］.国际病理科学与临床杂志，2011，31（4）：333－337.

［12］Lee JY，Park M K，Park JH，etal.Loss of the polycomb protein Mel-18 enhances the epithelial-mesenchymal transition by ZEB1 and ZEB2 expression through the downregulation of miR-205 in breast cancer［J］.Oncogene，2014，33（10）：1325－1335.

［13］SiW，Huang W，Zheng Y，et al.Dysfunction of the reciprocal feedback loop between GATA3-and ZEB2-nucleated repression programs contributes to breast cancermetastasis［J］.Cancer Cell，2015，27（6）：822－836.

Expression and significance of BCL-6 and ZEB2 in breast cancer

ZHENG Li1，ZHAO Min1，ANG Lin1，HUANG Jin1，WANG Jin1，ZOU Qiang1，WU Zheng-sheng2
（1Department of Pathology，the Second People’s Hospital of Hefei，Hefei 230011，China；2Department of Pathology，AnhuiMedical University，Hefei 230032，China）

PurposeTo explore the biological significance of BCL-6 and ZEB2 in invasion，metastasis and prognosis of breast cancer.M ethodsThe expressions of BCL-6，ZEB2 protein andmRNA were detected respectively in 228 cases of breast cancer and 80 cases of breast benign lesions by immunohistochemical SP two-step staining and situ hybridization.ResultThe expression levels of BCL-6，ZEB2 protein and mRNA in breast cancer tissueswere significantly higher than in breast benign lesions（P＜0.05）.The expressions of BCL-6 was positively correlated with tumor size，lymphaticmetastasis，histological grade，TNM staging and HER-2 expression（P＜0.05）. The expressions of ZEB2 was positively correlated with tumor size，lymphatic metastasis，TNM staging and HER-2 expression （P＜0.05）.The overall survival and relapse-free survival of BCL-6 and ZEB2 positive expression were significantly less than the negative expression（P＜0.01）.ConclusionThe BCL-6 and ZEB2 are closely correlated with the evolution process of breast cancer，which may become importantmeans for monitoring and warning the metastasis，invasion，and prognosis of breast cancer.

breast neoplasm；BCL-6；ZEB2；immunohistochemisty；situ hybridization

R 737.9

A

1001－7399（2017）01－0050－05

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.013

接受日期：2016－11－21

合肥市自主创新政策“借转补”项目［合科（2014）71号］

1合肥市第二人民医院病理科，合肥 230011

2安徽医科大学病理学教研室，合肥 230032

郑 丽，女，硕士研究生，医师。E-mail：zhengli352＠163. com

赵 敏，女，主任医师，通讯作者。E-mail：zhao.min.hi＠163.com