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免疫检测技术在中药质量快速评价中的应用

2017-03-20张波南铁贵孙晴刘洪美丁凤伟王颖

中国中药杂志 2017年3期
关键词:快速检测质量评价

张波+南铁贵+孙晴+刘洪美+丁凤伟+王颖

[摘要]中药质量评价分为有效性和安全性2个方面,现有的中药质量评价方法以仪器检测方法居多,不能满足生产及生活中简单、快速、現场化的实际需求。免疫检测技术具有灵敏度高、特异性强、操作简单、检测快速、检测成本低、仪器依赖性低、易于现场化等优点,在临床检验、食品安全检测及环境污染监测等领域应用广泛。近些年来,免疫检测技术逐渐应用于中药质量控制领域,涉及中药有效成分的定量检测,中药有害物质检测,中药外源性污染物检测等方面。该文综述了应用较广的酶联免疫检测法和胶体金免疫检测试纸条技术的原理及在中药质量评价中的应用,该技术在中药质量现场快速检测中具有较好应用前景。

[关键词]质量评价; 快速检测; 酶联免疫检测; 胶体金免疫检测试纸条

[Abstract]The quality evaluation of traditional Chinese medicine can be divided into two aspects, effectiveness and safety. The existing methods for evaluating the quality of traditional Chinese medicine(TCM) are mostly based on the testing instruments, which can not meet the practical needs of simple, rapid and on-site in production and life. Immunoassay, characterized by simple, rapid, sensitive, specific, low-cost and high-throughput, is widely used in the fields of clinical diagnosis, environmental pollution monitoring, food safety testing, and other fields. In recent years, immunoassay technology has been gradually applied in the field of quality control of TCM, involving quantitative detection of effective components of TCM, detection of harmful substances in TCM, and detection of exogenous pollutants in TCM. This paper summarizes the principle of the wide application of ELISA and colloidal gold immunostrip technology and its application in quality evaluation of TCM, this technique has a good application prospect in the field of rapid detection of the quality of TCM. In this paper, the principles of the widely used ELISA and colloidal gold immune test strip technology as well as their application in quality evaluation of TCM were reviewed, and the results showed that this technique had a good application prospect in the field of rapid detection of the quality of TCM.

[Key words]quality evaluation; fast detection; ELISA; colloidal gold immune test strip

中药有效性和安全性是中药质量评价的2个重要标准。化学成分是中药发挥疗效的物质基础,其中又以指标性成分的含量高低作为中药质量控制及品质优劣评价的重要指标。近些年来,随着中药野生资源的大量减少,及基于对中药质量稳定性和可控性的需求,中药栽培品逐渐成为中药市场的主要来源。在中药的栽培管理过程中,农药的大量使用导致农残偏高,加上栽培环境污染或加工方法不当引起的重金属超标;存储不当引起的细菌、真菌污染以及中药中自身存在的有毒、有害物质均影响到中药的用药安全。

随着中药质量标准和消费者健康安全意识的提高,无论是生产者还是消费者都希望获得一种简单、快速、高通量、现场化的检测方法来评价所用中药的质量及安全性。目前,针对中药材的质量和安全性评价应用最多的仍是基于仪器分析的技术手段,如高效液相色谱、气相色谱、质谱、色谱-质谱联用技术等。仪器分析具有灵敏度高、精密度高、重现性好、易于标准化等优点,但无法满足简单、快速检测的要求。免疫检测技术是基于抗原与抗体的特异性反应而建立的,对抗原或抗体实现定性定量检测的方法。免疫检测技术具有样品用量小,操作简单,检测快速,检测成本低廉,高通量及易于现场化等优点。目前在中药研究领域中应用最多的免疫检测方法有适用于高通量快速定量检测的酶联免疫检测吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)以及适用于现场快速检测的免疫胶体金试纸条技术(gold immunochromatography assay,GICA)。

1 免疫检测技术

1.1 抗原

中药成分种类繁多,根据化合物相对分子质量大小通常可分为2类,一是大分子物质,如蛋白质、氨基酸、多糖类(淀粉、纤维素、植物凝集素等);另一类是小分子物质(相对分子质量小于5 000),如黄酮类、有机酸类、生物碱类、皂苷类、萜类、蒽醌类物质等。从免疫学的角度来讲,大分子物质既具有免疫原性又具有反应原性,属于完全抗原,而小分子物质只具有反应原性而不具有免疫原性,无法刺激动物产生免疫应答,属于半抗原。中药中小分子物质占到90%以上,为了制备抗体和建立相应的免疫检测方法,需要将小分子物质与蛋白质载体相结合制备成完全抗原。人工抗原的合成方法主要是基于小分子化合物的活性基团来选择,如针对羧基多采用碳二亚胺法、活泼酯法、琥珀酸酐法;氨基多采用戊二醛法;糖基可采用高碘酸钠法;酚羟基可采用混合酸酐法;芳香氨基采用重氮化法等。廖国平[1]、赵宁毅[2]等对中药成分半抗原的制备方法、原则、佐剂和载体的选择以及完全抗原的鉴定方法等均做了详细介绍。

1.2 抗体

根据抗体的来源及应用不同,可将抗体分为多克隆抗体(pAb)、单克隆抗体(mAb)、基因工程抗体3种。多克隆抗体通常是从致敏后的动物血液中分离血清直接使用,或进一步纯化后得到,但仍有较多杂蛋白。单克隆抗体是指由一个B细胞分泌的,性质均一、灵敏度高、特异性强的抗体,通过杂交瘤细胞技术获得。基因工程抗体是指利用重组DNA及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配,转染适当受体细胞后表达的重组抗体分子。目前,在中药研究领域中以多克隆抗体和单克隆抗体应用较多。多克隆抗体制备周期短,获取方法简单,但抗体的性质不均一,批次间差异明显,抗原消耗量大。相比之下,单克隆抗体则灵敏度高、特异性强、性质均一且可以大量制备,是抗体制备的主流趋势。

2 ELISA在中药质量快速评价中的应用

ELISA是一种将抗原抗体的特异性结合反应与酶的高效催化反应相结合,从而实现对抗原或抗体的定性定量检测的方法。ELISA是一种固相检测方法,在中药有效成分的检测中以检测小分子化合物的间接竞争法应用最为广泛,其基本原理见图1。

2.1 ELISA在中药品质优劣评价中的应用

中药的品质评价既包括真伪鉴定也包括品质优劣评价。ELISA用于药材真伪鉴定可通过特异性物质的有无来判断,属于化学鉴定范畴,但由于寻找真伪鉴定特异性物质难度很大,因此ELISA在药材基原鉴别中的研究及应用较少。品质优劣评价多是检测质量控制指标性成分的含量高低,属于定量检测。ELISA检测技术具有操作简单、检测快速、灵敏度高、高通量等优点,弥补了HPLC检测技术的不足,为药典中指标性成分的快速检测提供了补充。ELISA的技术优势使药材监管更加方便快捷,马丽玲等[3]利用ELISA检测方法,对10份广州市售柴胡药材中的柴胡皂苷A进行含量测定,发现其中3份样品不合格,整个检测过程仅需2 h,较HPLC大大提高了检测效率。Zhang等[4]通过建立的木犀草苷ELISA检测方法,可有效区分山银花与金银花中木犀草苷的含量高低。目前,已有10多味中药材,20多种化学成分的抗体及ELISA检测方法的报道,其化学成分种类及相应的检测范围信息见表1。

2.2 ELISA在中药安全性评价中的应用

2.2.1 有毒成分及有害成分 随着生活质量的提高,消费者对养生中药的需求量不断增加,且更关注中药的安全性。影响中药安全性的因素主要有中药内源性的有毒、有害物质和外源性的农药残留、重金属污染、染色剂污染及真菌毒素污染等。有毒物质本身也是有效物质,但是如果存在不合理用药便会对人体造成伤害,如马钱子中的番木鳖碱;乌头中的乌头碱类成分等。Kido等[27]制备了乌头碱类成分的单克隆抗体,并建立了ELISA检测方法,其检测范围为100~1 500 mg·L-1,该方法应用于乌头中乌头碱的检测与HPLC检测结果相关系数在0.9以上,为川乌的质量控制及临床安全用药提供了新的检测方法。有害物质是指与药物治疗效果无关的,对人体有害的一类物质,如细辛和天仙藤中的马兜铃酸A。南铁贵等[11]通过碳二亚胺法合成了马兜铃酸A的完全抗原并制备了抗马兜铃酸A的单克隆抗体,所建立的ELISA检测方法IC50为1.9 mg·L-1,通过ELISA检测马兜铃酸A含量可有效区分木通与川木通。

2.2.2 真菌毒素类 中药在生产、储存等过程中易产生一些真菌毒素,如黃曲霉毒素(AF)、赭曲霉毒素、T-2毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素、桔青霉素、展青霉素等,对人体具有毒性,需加强控制。2015年版《中国药典》对19种中药中的AF含量做了明确限定,即每1 kg中药含AFB1不得过5 μg,AFB1,AFB2,AFG1和AFG2的总量不得过10 μg,对其他毒素尚未做出明确限量规定。高效液相色谱法和液质联用技术具有专属性较强,重复性较好,假阳性率较低,可以实现多成分同时检测等优点,被选为药典AF检测的指导方法。

ELISA凭借其具有高灵敏度,高特异性和适宜大批样品集中检测等优势在中药AF检测中应用较广。梁月秋等[31]利用ELISA检测了37种中药材和22批中成药AFB1污染情况,结果中药材和中成药的AFB1污染比例分别达到了92%,86%。李汶等[32]采用同样方法对30种中药材和7个品种20多个中成药样品进行了AFB1含量检测,发现所有样品均存在不同程度的AFB1污染,且含量均超过5 μg·kg-1。果实种子类中药由于富含油脂,在储藏过程中易引起真菌污染,张爱婷等[33]对13种果实种子类中药的AFB1含量进行了检测,结果显示益智仁和薏苡仁中AFB1含量超标,ELISA在整个检测过程中呈现出操作简单、快速、高通量、适用于复杂基质检测等优点,检测效果良好。陈建民等[34]比较了AF的薄层色谱检测法、ELISA检测法和免疫亲和柱净化-高效液相色谱(ICA-HPLC)检测法,认为ELISA检测技术可发展成为AF快速检测技术。但在其研究中发现ELISA检测结果与ICA-HPLC检测方法相比AFB1的检出量明显偏高,具体原因可能是ELISA试剂盒所用的抗体存在一定交叉反应,特异性不够;再者,不同检测基质差异显著且成分较为复杂,可能存在一定的基质干扰。因此,制备高亲和力高特异性的抗体是ELISA检测技术的关键。部分有关AF抗体总结见表2。

2.2.3 农药残留 随着自然资源的不断枯竭及中药需求量的不断增大,人工栽培品成为中药市场的主流,尤其是近十多年中药材规范化生产概念的提出和《中药材生产质量管理规范(GAP)(试行)》的出台大大提高了中药材的栽培种类和栽培面积,郭兰萍等[41]系统回顾了中药材规范化生产10年来的成果、存在的问题,并提出了改进意见。在中药的栽培过程中,为防治病虫害及去除杂草,农药的使用频率及使用量不断提高,导致农药残留现象普遍存在,严重影响中药材质量。王丽丽等[42]分析了我国中药农药残留的特点,指出有机氯农药残留最多,有机磷和拟除虫菊酯类农药次之,氨基甲酸酯类农药残留极少。目前,农药残留的检测方法主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、液质联用技术(LC-MS)、气质联用技术(GC-MS)等。ELISA检测技术凭借其超高的灵敏度(ng-pg级)和高通量检测的优势在食品农药残留检测中应用较为广泛。高宏斌等[43]综述了免疫分析技术在拟除虫菊酯类农残检测中的应用;李卫霞[44]、武中平[45]等总结了部分国内外关于食品中杀虫剂、杀菌剂、除草剂和生物调节剂等农药残留ELISA检测技术的文献报道,均可为中药材农残的检测提供参考。

2.2.4 重金属 重金属污染问题严重影响了药材质量,同时威胁到临床用药安全,因此我国药典已对铅、镉、砷、汞、铜等5种重金属含量做了限量规定。药材生长环境污染、药材自身富集作用以及生产加工过程中的带入污染均会引起中药重金属污染,吴亚东等[46]检测了17种常用中药材饮片中的5种重金属含量,17种药材均存在重金属超标的现象,且以镉含量超标尤为突出。2015年版药典中重金属的检测方法采用比色法,此外还有紫外分光光度法、HPLC、电耦合等离子体质谱法、火焰萃取法、原子吸收法、分子荧光法、等离子发射光谱法、免疫检测法等[47]。目前,基于特异性抗体的重金属ELISA检测方法多用于食品(粮食、蔬菜)检测及环境监测(土壤、水),在中药材基质检测中的应用较少。5种重金属离子中,以镉离子研究最为广泛,砷离子研究最少,见表3。

3 胶体金免疫色谱技术在中药质量快速评价中的应用

胶体金标记抗体技术是以胶体金颗粒为示踪标记物或显色剂,应用于抗原抗体反应的一种新型固相免疫标记技术。发展至今,已广泛应用于光镜、电镜、流式细胞仪、免疫转印、体外诊断等众多领域。1962年,Feldherr和Marshall首次介绍了胶体金作为一种电子显微镜水平的示踪标记物;1971年,Faulk等将胶体金引入免疫化学,此后该技术在生物医学领域应用广泛;1990年,Beggs等用免疫色谱技术检测孕妇尿液HCG,实现了早孕诊断的免疫学快速检测技术,即胶体金免疫色谱法。

3.1 胶体金标记抗体

胶体金是指呈胶体状态,大小均匀的金颗粒,根据金颗粒大小(1~100 nm)及金浓度不同显橘红色至紫红色。胶体金的制备通常采用化学还原法,基本原理是氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下聚合成一定大小的金颗粒,其表面带有大量负电荷,产生的静电排斥力使其在水中保持稳定的胶体状态,故称胶体金。在范德华力作用下,胶体金与抗体发生非特异性结合,使抗体呈红色但并不影响抗体的生物活性。

3.2 胶体金免疫检测试纸条

GICA是将胶体金标记抗体技术与纸色谱技术相结合的一种定性/半定量检测方法。免疫色谱试纸条是以硝酸纤维素膜为载体,滴加在膜条一端的待测液体利用微孔膜的毛细管作用慢慢向另一端渗移,在此过程中发生相应的抗原抗体反应并通过胶体金的颜色判定结果。试纸条是胶体金标记技术在免疫色谱中应用的一个重要形式,其组成分为样品垫、胶体金标记物吸收垫(载有金标抗体)、硝酸纤维素膜和吸水纸。小分子物质检测原理同ELISA,均为竞争法,见图2,当在试纸条样品垫滴入待测提取液后,在毛细管作用下,溶液沿试纸条扩散,至胶金垫时发生抗原抗体特异性结合,至硝酸纤维素膜上包被抗原线(检测线,T线)时包被抗原與待检抗原竞争结合金标抗体,至第二抗体(对照线,C线)时,金标抗体与二抗结合。在C线出现红线的前提下,根据T线是否出现红色进行判断。如果样本中待检测物质含量大于一定的浓度,T线不显色,结果为阳性,反之,T线显红色,结果为阴性;如果C线不出现红色,则说明试纸条失效。

3.3 GICA在中药品质优劣快速评价中的应用

GICA具有灵敏度高、特异性强、样品处理简单、轻便易携带、检测快速(检测时间5~15 min)、检测成本低、结果肉眼可辨等优点,近10年来逐渐应用于中药活性成分的半定量检测,并在中药现场快速检测方面具有较好的发展前景。日本学者Putalun团队较早应用此技术,并先后制备了检测番泻苷A和番泻苷B(检测限为125 mg·L-1[58]、甘草酸(检测限250 mg·L-1[59]、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1(检测限为2 000 mg·L-1[60]、积雪草苷(检测限12.5 mg·L-1[61]、桑皮苷A(检测限2 mg·L-1[62]的胶体金免疫检测试纸条,应用于中药材及中成药的检测。国内研究较少,2006年,Zhao等[63]制备了甘草酸胶体金免疫色谱试纸条(检测范围20~50 mg·L-1),通过自来水浸泡甘草样品30 min即可实现甘草酸的半定量检测,整个过程操作简便快速。南铁贵等[64]在人参皂苷Re单克隆抗体的基础上,制备了人参皂苷Re胶体金免疫色谱试纸条(检测限为200 mg·L-1),自来水浸提人参样品30 min后,试纸条检测10 min即可实现人参的真伪优劣鉴定,且鉴定结果与ELISA结果一致,无假阳性或假阴性结果出现。

3.4 GICA在中药安全性评价中的应用

GICA灵敏度通常在纳克及皮克级别,且使用方便,技术水平要求不高,易于推广,在临床医学(兽医临床)检测、食品安全、农兽药残留等领域应用广泛,尤其是食品安全方面的真菌毒素检测和农药残留检测均可借鉴用于中药材或中成药的检测。杨英等[65]利用胶体金标记抗AFB1单克隆抗体,并组装制备了免疫色谱试纸条用于23份莲子样品AFB1的检测,其中6份样品结果呈阳性,所有样品经UFLC-MS/MS确证后证实试纸条无假阳性和假阴性结果。王宇婷等[66]就胶体金色谱技术在包括真菌毒素、农药残留、重金属污染、抗生素残留等外源性有害物质快速检测中的应用做了详细介绍。徐超莲等[67]总结了胶体金免疫色谱法在食品天然存在的危害物质检测中的应用研究进展。

4 总结与讨论

随着生活质量的提高,消费者对健康及食品安全关注度越来越高,中药不仅是治病救人的药物,同时还以保健品,药食同源的食材等诸多身份呈现给广大消费者。由于中药野生资源的匮乏,环境污染,中药栽培与生产过程中的带入污染等因素导致中药质量屡屡出现问题,因此中药质量的监测不应仅局限在药材监管部门和制药企业,更应该推广到广大的消费群体。所以,建立一种操作简单、使用门槛低、无仪器依赖且易于推广使用的中药质量现场快速检测方法是十分必要的。

ELISA检测法和GICA检测法分别作为高通量检测和现场快速定性/半定量检测技术在中药质量控制领域的应用逐步展开,在方法建立过程中应注意以下几点。①根据中药质量控制的要求不同建立方法:《中国药典》中的质量控制指标有些为不同类成分(如金银花中的绿原酸、木犀草苷),有些为同一类成分总和(如大黄中的蒽醌类成分)。对于绿原酸的含量测定,绿原酸的结构类似物种类多,含量也较高,由于抗体往往存在一定交叉反应,所以对检测结果会有影响,这就要求抗体的特异性越高越好;对于大黄中的蒽醌类成分,抗体交叉反应高,则可一次完成5种成分的总含量检测,无需制备各个成分的抗体,减少了成本与检测时间,所以抗体的特异性不需要太高。②配套提取方法的建立:中药基质复杂,无关化学成分可能会影响目标成分检测结果的准确性,加上“快速检测”的目标需求,建立待检成分的快速提取方法也是整个快速检测体系中的关键环节。③方法稳定性:免疫检测方法易受试剂、材料、环境等因素影响,尤其是抗体易失活。如何保证抗体的活性及方法的稳定性是需要亟待解决的问题,也是方法实现大面积推广的前提。④试纸条定量检测:目前胶体金试纸条多用于定性、半定量检测,开发便携式、微型化、自动化化的试纸条定量检测仪是未来的发展趋势。⑤中药材基原鉴定:基于化学成分的免疫检测技术在中药材基源鉴定中较难实现,核酸试纸条可提供一个有效途径。

免疫检测技术为中药质量优劣及安全性评价提供了简单、快速、高通量、现场化的检测方法,优势显著,应用前景广阔。

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[责任编辑 孔晶晶]

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