邹婧泽+严准+程毅+陈佳+曾粮斌+李智敏+余永廷+高春生

摘要：为有效防治萝卜（Raphanus sativus L.）软腐病，提高萝卜产量和质量，从江苏徐州、浙江萧山和湖北利川3个萝卜主产区分别采集萝卜软腐病病样并进行病原菌的分离鉴定及致病力测定。通过结合菌落形态、生理生化指标测定和16S rDNA基因序列分析，确定3株病原菌属于胡萝卜果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum）的2个亚种，其中2株为Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense，另1株为Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum。致病力测定分析表明，3株病原菌的致病力存在显著差异，随温度的升高均呈现出增强的趋势。

关键词：萝卜（Raphanus sativus L.）；软腐病；致病力差异

中图分类号：S436.31；S631.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）23-6130-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.030

Abstract：In order to control soft rot disease of radish，increase its yield and quality，the pathogen of radish soft rot disease was isolated and identified from disease samples collected from three main production areas of radish in Jiangsu Xuzhou， Zhejiang Xiaoshan and Hubei Lichuan，and its pathogenicity was evaluated later. Based on morphological observation，biological and physiological methods，and 16S rDNA sequence analysis，three strains were identified belonging to two subspecies of Pectobacterium Carotovorum，that is Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense and Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum. The pathogenicity test was carried out by inoculating these pathogen isolates，and the results showed that three strains had significant differences in pathogenicity with a common increase ability as the temperature increased.

Key words：Raphanus sativus L.； soft rot disease； pathogenicity difference

萝卜（Raphanus sativus L.）是十字花科萝卜属蔬菜作物，世界各地均有栽培，其中中国年均播种面积在120万hm2以上，占世界种植面积的40%，是中国第二大蔬菜作物[1]。随着高山萝卜等反季节萝卜的大面积发展，萝卜已经从秋冬供应的时令菜逐渐发展为四季持续供应的周年菜，且周年供应的萝卜已经成为国家调控蔬菜价格体系的重要产品[1-3]。

软腐病又称腐烂病，是十字花科蔬菜中危害最严重的病害之一。其寄主范围广，不仅侵染十字花科蔬菜，还危害茄科、菊科等多种蔬菜。雨季种植萝卜，软腐病的病株率和产量损失一般都在8%以上， 发病重的田块萝卜病株率和产量损失达30%以上，对菜农造成较大的经济损失[4]。近年来，受全球变暖和规模化种植的影响，极端天气频发，长期连作土壤中软腐病病原基数大，加重了萝卜软腐病害的发生。为此，试验分别从江苏徐州、浙江萧山和湖北利川的3个蘿卜主产区分离并鉴定萝卜软腐病病原菌，比较不同地区的萝卜软腐病病原菌致病力差异和亲缘关系，以期为更好地控制萝卜软腐病病情奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离和培养

2015年4～7月，从江苏徐州、浙江萧山和湖北利川的3个萝卜主产区分别采集萝卜软腐病病样。选取具典型软腐病病状的萝卜块根，表面清洗后，用灭菌解剖刀切取小块萝卜块根病健交界处的组织，用75%的乙醇消毒30 s，无菌水清洗3次后，置于3 mL无菌水中，切碎组织，静置10～15 min，用灭菌牙签蘸取少量组织液在LB培养基上划线培养。在28 ℃培养箱中倒置培养18～24 h后，挑取单菌落经过3～5次纯化培养。将纯化后的细菌挑取单菌落接种于3 mL LB液体培养基中，28 ℃培养18～24 h后，加3 mL体积分数60%的甘油，保存于-80 ℃冰箱中备用。

1.2 病原菌致病力测定

1.2.1 菌悬液的配制 将菌株活化，挑取单菌落接入LB液体培养基培养过夜，用无菌0.9% NaCl生理盐水洗涤3次后，配制成2×108 CFU/mL的菌悬液。

1.2.2 病原菌回接 分别选取长势一致且健康的萝卜叶片和萝卜块根，表面清洗后，用75%乙醇表面消毒，晾干。萝卜叶片置于装有2层无菌滤纸的15 cm无菌培养皿内，并加5 mL无菌水保湿。在距叶柄切口1～2 cm处，用一次性无菌注射器注射5 μL菌液，每个菌株重复4次，用封口膜封住培养皿口，置于28 ℃培养。萝卜块根置于用75%乙醇消毒的无菌托盘内，用灭菌解剖刀在其中心划5 mm×5 mm的十字伤口，深度为5 mm，向其中部注射5 μL菌液，每个菌株重复4次，用保鲜膜将托盘封住，置于28 ℃培养。相同条件下，以注射无菌0.9% NaCl生理盐水侵染的植物组织为对照。接种后每12 h观察一次发病情况。萝卜发病后，再次分离病原菌并纯化，与接种的病原菌比较。

1.2.3 病原菌致病力差异测定 参照胡娜娜等[5]的方法测定病原菌致病力。选用健康大白菜叶柄基部进行致病力测定。设置22、25、28 ℃ 3个温度，每个温度每个菌株重复10次，以0.9%的无菌生理盐水侵染的植物组织为对照。在接种12、24 h时分别测量病斑长度和宽度，取平均值作为平均病斑大小。

1.3 病原菌形态及生理生化指标测定

将纯化的菌株接种于NA培养基中划线培养18～24 h，观察菌株生长状况和形态特征。革兰氏染色反应参照米琴等[6]的方法，鞭毛染色参照郭坚华等[7]的方法，于显微镜下观察。过氧化酶试验、氧化酶试验、明胶液化、硝酸盐还原、亚硝酸盐还原、葡萄糖发酵、柠檬酸盐利用、纤维素分解、果胶水解、马铃薯腐败、硫化氢试验、37 ℃生长、苯丙氨基酸脱氨酶以及病原菌对蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇和阿拉伯醇的利用试验均参考文献[8]。

1.4 病原菌16S rDNA鉴定

1.4.1 基因组DNA的提取 将保存于-80 ℃的菌株在LB固体培养基上划线，在28 ℃下培养18～24 h，挑取单菌落在LB液体培养基中培养过夜。细菌基因组提取采用北京康为世纪生物科技有限公司的通用柱式基因组提取试剂盒进行DNA提取。

1.4.2 16S rDNA基因片段扩增 试验用引物为16sF：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和16sR：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR扩增。采用50 μL反应体系：2×Taq PCR MasterMix 25 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 20 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR扩增产物取5 μL，用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.4.3 16S rDNA序列系统进化树构建 将测序结果在NCBI中进行BLAST分析，采用MEGA6.06软件中Maximum Likelihood法构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 病原菌的回接测定

萝卜叶片和萝卜块根在病原菌接种12 h后均开始出现病症。叶柄接种处出现湿润状淡褐色病斑后，沿叶脉向上扩展，叶柄逐渐变软腐烂；萝卜块根接种处病斑呈水浸状，并以接种处为中心向四周扩展，病部组织逐步软化腐败；叶柄基部和块根病部组织均渗出黄褐色黏液，并散发出臭味（图1）。其症状与田间采集的萝卜软腐病样症状一致。从发病的萝卜上再次分离得到病原菌，与原病原菌相同，符合柯赫氏法则。

2.2 病原菌形态及生理生化特征

分离得到的3个菌株在LB固体培养基上均形成乳白色圆形或不定型菌落，中部凸起，表面光滑；菌体短杆状，2～8根周生鞭毛，革兰氏染色阴性。

通过生理生化测定，3个菌株除柠檬酸盐利用外均表现一致。过氧化酶阳性，氧化酶阴性，苯丙氨基酸脱氨酶阴性，硝酸盐还原阳性，亚硝酸盐还原阴性，果胶水解阳性，葡萄糖代谢为发酵型，能使明胶液化，可分解纤维素，能引起马铃薯腐败，能从半胱氨酸中产H2S，能在37 ℃下生长，并且均能利用蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇和阿拉伯醇（表1）。这些生物学特征符合文献[9]中对胡萝卜软腐欧文氏菌（Pectobacterium carotovorum）的描述。

2.3 16S rDNA序列分析及系统发育树构建

将3个菌株的16S rDNA基因测序结果进行BLAST分析，结果显示菌株LC1和XZ1与已发表的Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis（Pcb）序列相似性均达99%。菌株XZ1与已发表的Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum（Pcc）序列相似性达99%。以Proteus hauseri strain S3-4为外组，用MEGA6.06软件中Maximum Likelihood法构建系统进化树（图2）。结果表明，LC1、XZ1分别与P. carotovorum subsp. brasiliense strain KP187495.1、P. carotovorum subsp. brasiliense strain KU997680.1聚为一类。XS1与P. carotovorum subsp. carotovorum strain JF926733.1聚为一类。

2.4 病原菌的致病力差异测定

参照胡娜娜等[5]的方法测定病原菌致病力差异，发现在22、25、28 ℃下，3个菌株致病力存在明显差异（图3）。在相同温度下，病原菌致病力由低到高分别为LC1、XZ1和XS1。同一菌株，随温度的升高，发病程度也逐渐加重（表2）。亚种与亚种之间病原菌致病力存在差异，属于P. carotovorum subsp. carotovorum strain的XS1致病力高于属于P. carotovorum subsp. brasiliense strain的LC1和XZ1。亚种内病原菌致病力也存在着差异，在同等条件下，LC1的致病力小于XZ1。

3 小结与讨论

本研究从湖北利川、江苏徐州和浙江萧山3个萝卜主产區的萝卜软腐病病样上分别得到菌株LC1、XZ1和XS1，通过对其进行生物学特性分析和16S rDNA序列分析， 鉴定得到LC1和XZ1为P. carotovorum subsp. brasiliense strain，XS1为P. carotovorum subsp. carotovorum strain。

病原菌主要从植物自然裂口和伤口侵入植株，温度高、湿度大有利于软腐病的发生。本研究发现，胡萝卜果胶软腐杆菌的两个亚种P. carotovorum subsp. brasiliense 和P. carotovorum subsp. carotovorum在温度的变化下，致病力变化趋势较为一致，均在一定温度范围内随温度的升高而升高。近年来，受全球气候变暖和极端天气的影响，温度升高和连续降雨机率增加，加之规模化种植的连作效应，土壤病原菌基数大，导致生产上的软腐病病情逐年加重，需要引起足够重视。

在自然生态体系下，寄主植物、病原菌和环境条件三者相互影响。病原菌自身的遗传变异在长期的自然选择和人为选择下，形成不同的病原菌群体。本研究中，不同萝卜种植区分离得到的萝卜软腐病病原菌存在差异，即使同属于一个亚种，致病力也存在着明显差异。

根据以往的文献记录，油菜和十字花科蔬菜软腐病病原菌为P. carotovorum subsp. carotovorum strain[10]。自2004年Duarte等从马铃薯黑胫病组织分离到P. carotovorum的新亚种P. carotovorum subsp. brasiliense后，陆续有报道该亚种能侵染芹菜、黄瓜、红辣椒、大白菜和甜菜等作物[11-14]。亚种之间致病力也存在不同，本研究中属于P. carotovorum subsp. carotovorum 的XS1致病力高于属于P. carotovorum subsp. brasiliense的LC1和XZ1。但是否P. carotovorum subsp. carotovorum亚种的致病力高于P. carotovorum subsp. brasiliense亚种，由于菌株样本少而无法得出该结论，有待进一步的调查研究。

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