王艳红++郑小亮++曹宁++贾桂燕++岳才军

摘 要：该文对中度嗜盐菌Halobacillus Y5的生物学特性进行了研究。结果表明：Halobacillus Y5菌株的最佳生长温度为30℃，生长较佳的酸碱度范围为7.0～9.0，NaCl耐受范围为3%～15%（w/v），最适浓度为9%（w/v）；营养条件方面，该菌生长的最适碳源为蔗糖，最适氮源为蛋白胨。

关键词：中度嗜盐菌；Halobacillus；生物学特性

中图分类号 Q939.96 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）04-0019-03

Study on Biological Characteristics of Halobacillus Y5

Wang Yanhong1，2 et al.

（1 Life Science and Technology College of Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing163319，China； 2 College of Life Sciences，Northeast Agricultural University，Harbin150030，China）

Abstract：The biological characteristics of Halobacillus Y5 was studied.The results showed that the optimal temperature was 30℃ and pH 7.0～9.0.The tolerance range of NaCl was 3%～15% （w/v），and the optimal concentration was 9% （w/v）.The optimal carbon source for Halobacillus Y5 was sucrose，the optimal nitrogen source was peptone.

Key words：Moderately halophilic bacteria； Halobacillus；Biological characteristics

喜盐芽孢杆菌属（Halobacillus）属于芽孢杆菌科（Bacillaceae），由Spring等于1996年创立[1]，它们分离自盐湖、盐土、海洋太阳能盐场等高盐环境中。Halobacillus Y5是分离自松嫩平原苏打盐碱地的一株喜盐芽孢杆菌，由于近年来的过度开荒和放牧，使得松嫩平原周边地区的生态环境遭到严重破坏，也加速了松嫩平原中部土地的碱化率。因此，本实验室对从松嫩平原盐碱地分离到的Halobacillus Y5进行了生物学特性研究，旨在为该菌的应用研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 实验所用菌株中度嗜盐菌Halobacillus Y5为本实验室分离纯化[2]并保存。

1.1.2 培养基 改进的S-G培养基[3]：Tryptone，10g/L；Yeast extract，5g/L；Casein，5g/L；KCl，2g/L；Sodium citrate，3g/L；MgSO4·7H2O，20g/L；Distilled water，1 000mL。pH值调至7.2～7.4。LB培养基：Tryptone，10.0g/L；Yeast extract，5.0g/L；NaCl，10.0g/L。pH值调至7.0。

1.1.3 供试碳源、氮源 所用碳源包括：D-葡萄糖、蔗糖、L-阿拉伯糖、麦芽糖、D-果糖、D-半乳糖、乳糖、D-棉子糖、L-鼠李糖、D-木糖、乙醇、丙三醇、D-甘露醇、醋酸盐、D-纤维二糖，共15种。所用氮源包括：L-丙氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-甲硫氨酸、硝酸铵、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸钾、尿素、牛肉膏，共11种。

1.2 方法

1.2.1 Halobacillus Y5的NaCl生长浓度 菌株在0、1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%和20%（w/v）的NaCl LB液体培养基中，按照1%的接种量接入种子菌液，28℃振荡培养48h后，测定OD600确定最适NaCl生长浓度。每个处理重复3次。

1.2.2 Halobacillus Y5的生长温度范围 在最适NaCl生长浓度的S-G培养液中，按照1%的接种量接入种子液，分别在4、10、28、30、32、35、37、40、50℃下培养，测定菌株的最适生长温度及范围。每个处理重复3次。

1.2.3 Halobacillus Y5的最适生长pH和范围 在已确定的菌株最适生长NaCl浓度的S-G培养液中，按照1%的接种量接入pH梯度培养基中。pH梯度为：3、4、5、6、7、8、9、10和11，pH3～6使用0.1M乙酸缓冲液调节，pH7～9使用0.1MTris-HCl缓冲液调节，pH10～11使用0.05M碳酸氢钾缓冲液调节，并于最适温度下培养。每个处理重复3次。

1.2.4 不同碳源对Halobacillus Y5的影响 将基础培养基中的碳源葡萄糖替换为等量的其他碳源：蔗糖、D-纤维二糖、L-阿拉伯糖、麦芽糖、D-果糖、D-半乳糖、乳糖、D-棉子糖、L-鼠李糖、D-木糖、乙醇、丙三醇、D-甘露醇、醋酸盐，以不加任何碳源的作为对照，其他条件不变，按照1%（v/v）接种量接入培养基，观察Halobacillus Y5的生长状况。每个处理重复3次。

1.2.5 不同氮源对Halobacillus Y5的影响 将基础培养基中的氮源硝酸铵替换为等量的其他氮源：L-丙氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-甲硫氨酸、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸钾、尿素、牛肉膏，以不加任何氮源的作为对照，其他条件不变，按照1%（v/v）接种量接入培养基，观察Halobacillus Y5的生长状况。每个处理重复3次。

1.2.6 数据统计与分析 用GraphPad Prism 6.01软件分析盐度、pH值、温度、不同碳源、氮源对Halobacillus Y5的生长影响并作图。

2 结果与分析

2.1 Halobacillus Y5的NaCl生长浓度 由图1可知，Halobacillus Y5在LB培养基中的NaCl耐受范围较广，在0%～20%（w/v）浓度下均能生长，在3%～15%（w/v）生长较好，最适NaCl浓度为9%。因此，该菌株的盐度耐受范围较广。

2.2 Halobacillus Y5的生长温度范围 由图2可知，Halobacillus Y5在S-G培养基中能够在4～50℃的温度范围内生长，在28～37℃生长较快，最佳生长温度为30℃。因此，该菌株具有一定的温度耐受性。

2.3 Halobacillus Y5的最适生长pH和范围 由图3可知，Halobacillus Y5在pH5.0～10.0范围内，均有不同程度的生长，但在pH 7.0～9.0范围其生长较好，pH 8.0生长最佳。因此，pH 8.0为其生长最适pH。

2.4 不同碳源对Halobacillus Y5的影响 将基础培养基中的碳源葡萄糖替换为等量的其他碳源后，发现菌株Halobacillus Y5能够利用蔗糖、醋酸盐、D-纤维二糖、D-棉子糖、L-鼠李糖，其中以蔗糖作为唯一碳源时长势最佳，不能利用麦芽糖、D-果糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、乳糖、D-木糖、乙醇、丙三醇、D-甘露醇（表1），可见，该菌对多种碳源都能利用，需求不严格。

2.5 不同氮源对Halobacillus Y5的影响 将基础培养基中的氮源硝酸铵替换为等量的其他氮源后，发现菌株Halobacillus Y5能够利用L-丙氨酸、L-组氨酸、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸钾、尿素、牛肉膏，其中以蛋白胨作为唯一氮源时生长最佳，不能利用L-赖氨酸、L-精氨酸、L-甲硫氨酸（表2）。

3 结论与讨论

研究结果表明，盐度、温度、酸碱度及营养条件等对Halobacillus Y5生长具有一定的影响。该菌最适NaCl浓度9%、最适温度30℃，相比其他pH而言，pH 8.0下生长最佳。Halobacillus Y5可以不同程度地利用多种碳源和氮源，碳源是微生物生长的一类营养物，根据微生物所能产生的酶系的不同，不同的微生物可利用不同的碳源，提供细胞生命活动所需的能量，在碳源利用上，以蔗糖效果最佳；氮源是可以被微生物用来构成细胞物质或代谢产物中氮素来源的营养物质，常被微生物用来合成细胞中含氮物质，微生物对氮源的利用具有选择性[4，5]，本实验在氮源利用上以蛋白胨效果最佳。

本实验通过对中度嗜盐菌Halobacillus Y5生物學特性的研究，明确了该菌的生长环境条件，为该菌的的深入研究奠定基础，也为盐碱地的开发利用以及耐盐碱基因的筛选及克隆提供理论支持。

参考文献

[1]Spring S，Ludwig W，Marquez M C，et al.Halobacillus gen.nov.，with descriptions of Halobacillus litoralis sp.nov.and Halobacillus trueperi sp.nov.，and transfer of Sporosarcina halophila to Halobacillus halophilus comb.nov[J].Int J Syst Bacteriol，1996，46：492-496.

[2]方中达.植病研究方法[M].第3版.北京：中国农业出版社，1998.

[3]SEHGAL S N，GIBBONS N E.Effect of some metal ions on the growth of Halobacterium cutirubrum[J].canadian journal of microbiology，1960，6： 165-169.

[4]闫征.南召县土地利用碳源碳汇及其变化分析[D].郑州：河南大学，2012.

[5]王端好.高活力山梨醇脱氢酶氧化葡萄糖酸杆菌选育及生物催化合成米格列醇的研究[D].西安：西北大学，2010.