（1.河南森隆兽药有限公司，河南 郑州 450000；2.河南省兽药监察所）

豫西地区鸡源大肠杆菌的耐药性研究

王清玲1，王丽2，刘淑鹤1

（1.河南森隆兽药有限公司，河南 郑州 450000；2.河南省兽药监察所）

从洛阳地区规模化养鸡场采集病料，经大肠杆菌显色培养基鉴定分离得耐药性大肠杆菌菌株。对21个抗菌药物进行抗菌活性测定，采用与膜通透促进剂乙二胺四乙酸二钠（EDTA）和β-内酰胺酶抑制剂舒巴坦钠联用测定抗菌药物的抗菌活性是否受影响。

大肠杆菌；耐药；96孔板；联合用药；MIC（50）；MIC（90）

大肠杆菌是埃希氏菌属中最重要的一种细菌，属于革兰氏阴性兼性厌氧杆菌。随着时间的推移，大肠杆菌的耐药率大幅度上升，多重耐药菌株剧增，耐药谱增宽，大肠杆菌的耐药问题已成为影响人类健康和养殖业发展的重要因素。近年来，集约化养禽场的其他疾病得到基本控制，但大肠杆菌病有明显的上升趋势，主要表现为大肠杆菌的耐药能力不断增强，使大肠杆菌病的动物临床用药选择空间不断缩小，治疗效果也很难保障。因此，对鸡源大肠杆菌的耐药性进行监测与分析，对于指导临床合理用药及控制该病的流行非常重要。近年来，埃希氏大肠杆菌的耐药性呈上升趋势，关于大肠杆菌对抗生素的耐药性问题，已在世界范围内引起重视［1］。

1 材料和方法

1.1 试验菌株

无菌采集病死鸡的心、肝、脾、气囊、十二指肠等，蘸取脏器的横切面组织液。

1.2 培养基

LB培养基：蛋白胨1.2 g、酵母粉0.6 g、氯化钠1.2 g、用蒸馏水补充至120 ml。麦康凯琼脂培养基：称取麦康凯琼脂粉末54 g，加入1 000 ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15 min备用。

1.3 器材与试剂

超净工作台，无菌96孔板，恒温振荡器，酶标仪，微量可调移液器，隔水式恒温培养箱，蛋白胨，酵母提取物，TTC粉剂，NaCl，麦康凯琼脂。

1.4 试验方法

1.4.1 大肠杆菌的筛选与培养 从采取的病料中钩菌划线于麦康凯琼脂平板上进行细菌培养与分离，置于37℃恒温箱中培养20～22 h观察生长情况，选定具有大肠杆菌菌落特征的可疑菌落继续进行培养保存。直至呈现单一的中间深红外周桃红色、圆形、边缘整齐、光滑、湿润、中等大小的菌落。

1.4.2 药敏性测定 采用96孔板微量稀释法将抗菌药物稀释成最终浓度分别为1 μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml、32 μg/ml、64 μg/ml、128 μg/ml 8个梯度浓度，加入菌悬液后将96孔板摇匀，然后放置在37℃恒温培养箱中培养20 h，再将96孔板各个附孔（边缘附空除外）各加20 μl TTC染色，摇匀，37℃静置4 h后吸出各附孔中的上清液，加200 μl二甲基亚砜（DMSO）溶解剩余的不溶络合物，用酶标仪测吸光度。

1.4.3 联合用药 选药敏性差的抗菌药物分别与舒巴坦钠和乙二胺四醋酸（EDTA）联合用药，再测抗菌药物与舒巴坦钠和EDTA同时联合用药，使加入的舒巴坦钠与抗菌药的浓度比为2∶1，EDTA的最终浓度为512 μg/ml，测定EDTA和舒巴坦钠单独与抗菌药物联用时对抗菌药物抗菌活性的影响，及同时与抗菌药物联用时对活性的影响。

1.5 结果判定

抗菌药物对大肠杆菌的抗菌活性用最终算出的最低抑菌浓度来判定。用联合用药的抗菌活性与单一用药时抗菌药物的抗菌活性对比，抑菌效果高于4倍或4倍以上的说明EDTA或（和）舒巴坦钠对抗菌药的活性有影响。

2 试验结果

根据药敏性在药物最高浓度（128 μg/ml）未达到MIC（50）的及在128 μg/ml时对应的最大抑菌率由小到大的顺序见表1：

根据MIC（50）值对抗菌药物进行药敏性由高到低进行排序，结果见表2：

根据MIC（90）值对抗菌药物进行药敏性由高到低进行排序，结果见表3：

表1 未达到最低抑菌浓度MIC（50）值的药物排序表

表2 按最低抑菌浓度MIC（50）值大小的药物排序表

表3 按最低抑菌浓度MIC（90）值大小的药物排序表

3 结果分析

3.1 单一用药试验结果分析

药敏试验结果显示在21个抗菌药物中有5个药物的抑菌效果已经很不明显，对此大肠杆菌基本丧失了抑制作用。剩下的16个抗菌药的抑菌率都可以达到MIC（50）值，保持一定的抗菌作用，占总药物数量的76.2%；只有6个药物抗菌能力可以达到MIC（90）值，具有很高的抗菌活性，占总药物的28.6%。可见此株大肠杆菌对卡那霉素、盐酸恩诺沙星、盐酸环丙沙星、头孢拉定和庆大霉素等药物同时产生了很高的耐药性；对盐酸黄连素、痢菌净、曲松钠、磺胺六甲嘧啶钠、盐酸头孢噻呋、磷酸素钠、盐酸土霉素、阿莫西林、乳酸诺氟沙星等药物有较高的敏感性，对这些药物的耐药能力还不是很明显；而对利福平、强力霉素、氟苯尼考、头孢噻肟钠、乳酸左氧氟沙星和痢菌净等药物有很高的敏感性，尚未对这些药物长生耐药性。

3.2 联合用药试验结果分析

卡那霉素的联合用药数据显示：卡那霉素与EDTA（512 μg/ml）联用其抗菌效果整体有明显的提高，随着卡那霉素浓度的增加，抗菌活性呈稳步提高趋势，但是提高的幅度并不大，卡那霉素的浓度在1 μg/ml和128 μg/ml的抑菌率分别是69.05%和80.60%；卡那霉素与舒巴坦钠联合用药的抑菌效果随卡那霉素和舒巴坦钠的浓度提高（抗菌药物∶舒巴坦钠=1∶2）有大幅度的提高，卡那霉素浓度在16 μg/ml时的抑菌率达到52.72%，卡那霉素浓度为128 μg/ml时抑菌率达到99.20%，卡那霉素与EDTA和舒巴坦钠同时联合用药的抑菌率提高的更加明显，卡那霉素浓度在1μg/ml的抑菌率可达74.03%，在16 μg/ml浓度时的抑菌率可达到91.85%，而在卡那霉素单一用药浓度为128 μg/ml时的抑菌率只有30.85%，所以，与卡那霉素单一用药相比，EDTA和舒巴坦钠分别或同时与卡那霉素联合用药时，对卡那霉素的抗菌活性均有很大的影响。

表4 联合用药对应的抗菌活性

盐酸恩诺沙星联合用药数据显示：盐酸恩诺沙星与EDTA联合用药的抑菌效果整体提高很多，抑菌率随盐酸恩诺沙星的浓度提高而稳步提高，盐酸恩诺沙星浓度在1μg/ml时候的抑菌率已经达到61.34%，在64 μg/ml时的抑菌率达到97.37%；盐酸恩诺沙星与舒巴坦钠联用的抑菌效果随药物浓度的提高有大幅度的提高，盐酸恩诺沙星的浓度在8 μg/ml时，抑菌率达到55.63%，浓度在32 μg/ml时的抑菌率达到93.67%；盐酸恩诺沙星与EDTA和舒巴坦钠同时联用的抑菌效果提高更加明显，在盐酸恩诺沙星的浓度为1μg/ml时候的抑菌率可高达74.97%，32 μg/ml的药物浓度抑菌率可达99.24%，而在盐酸恩诺沙星单一用药浓度为128 μg/ml时的抑菌率为32.96%，所以与盐酸恩诺沙星单一用药相比，EDTA和舒巴坦钠分别或同时与盐酸恩诺沙星联合用药时对盐酸恩诺沙星的抗菌活性均有很大的影响。

盐酸环丙沙星的联合用药数据显示：盐酸环丙沙星与EDTA联合用药的抑菌率整体有明显的提高，但随着盐酸环丙沙星的浓度增加其抑菌率的提高并不是很明显，盐酸环丙沙星的浓度在1 μg/ml和128 μg/ml的抑菌率分别是73.54%和86.25%；盐酸环丙沙星与舒巴坦钠联合用药的抑菌效果随盐酸环丙沙星的药物浓度的提高有大幅度的提高，盐酸环丙沙星的浓度在1 μg/ml和128 μg/ml的抑菌率分别是7.02%和99.80%，可见药物浓度对抑菌效果有很大影响，但是在药物浓度低于16μg/ml时盐酸环丙沙星与舒巴坦钠联合用药的抑菌率却比单一用盐酸环丙沙星的抑菌率低，而在浓度大于16 μg/ml时的抑菌率提升非常大，盐酸环丙沙星的浓度在32 μg/ml时抑菌率达到98.98%，可见盐酸环丙沙星与舒巴坦钠联合用药在药物浓度超过16 μg/ml时才有提高抗菌活性的作用，并且作用很明显。盐酸环丙沙星与EDTA和舒巴坦钠联合用药的抑菌效果不但对整体作用有提高，而且随药物浓度提高呈尾部提高的趋势，药物浓度在1 μg/ml时的抑菌率为74.22%，在16 μg/ml时的抑菌率达到92.34%，而盐酸环丙沙星单独用药时在浓度为128 μg/ml时的抑菌率为43.89%，所以与单一用药相比，EDTA和舒巴坦钠分别或同时与盐酸环丙沙星联合用药对盐酸环丙沙星的抗菌活性均有很大的影响。

头孢拉定联合用药数据显示：头孢拉定与EDTA联合用药的抑菌效果整体有很大提高，但是随头孢拉定的药物浓度的增加对应的抑菌率提高幅度却很小，头孢拉定的浓度在1 μg/ml和128 μg/ml的抑菌率分别是60.42%和85.93%；头孢拉定与舒巴坦钠联合用药的抑菌率随药物浓度呈大幅度的提高趋势，但是在头孢拉定的浓度为128 μg/ml时的抑菌率只达到65.46%，较单一使用头孢拉定时128 μg/ml的抑菌率为45.74%比，抑菌率的提升并不是很明显，由于联合用药时药物浓度在32 μg/ml时的抑菌率为57.56%，比单一用药时128 μg/ml抑菌率为45.74%的抑菌率要高，舒巴坦钠使头孢拉定的抑菌活性提高超过4倍，所以舒巴坦钠对头孢拉定的抗菌活性有影响。头孢拉定与EDTA和舒巴坦钠联合用药的抑菌率整体上有很大的提高，随药物浓度的提高抑菌率提高范围不大，头孢拉定浓度在1 μg/ml时候抑菌率为73.20%，在16 μg/ml时抑菌率达到93.65%，头孢拉定单一用药时浓度在128 μg/ml时的抑菌率为45.74%，所以，EDTA和舒巴坦钠同时与头孢拉定联合用药对头孢拉定的抗菌活性的影响非常大，而舒巴坦钠与头孢拉定联合用药对头孢拉定的抗菌活性影响较小。

综上所述，EDTA可以使抗菌药物的活性有很大的提高，抗菌药物浓度在1 μg/ml时的抑菌率可到达60%以上，对大肠杆菌病具有较强的治疗效果，并且EDTA的市场价格很低，适合于工业生产和养殖户的大规模使用；舒巴坦钠的抑菌效果随浓度的增加而增加，一般在药物浓度为16 μg/ml时候抑菌率才可以达到50%以上，但是不同药物对舒巴坦钠的影响效果不同，并且舒巴坦钠的市场价格较贵，不适合大规模使用。

4 讨论

该试验的药敏数据一方面为该地区的用药提供了一定的参考价值，另一方面也显示了该地区动物源性大肠杆菌的耐药性极其严重，有必要对本地区动物源性细菌的耐药性进行跟踪监测［2］。由于各地区的养殖模式和用药习惯不同，导致细菌的耐药性也存在一定的差异，所以各地区要根据实际情况对本地区细菌的耐药性进行监测和抗菌药的用药管理。另外，通过对耐药菌的耐药机理研究，合理搭配药物使失去抗菌活性的药物重新恢复抗菌能力，从而有效控制细菌耐药谱的扩增。

［1］汪洋，王育娜，易力，等.洛阳地区鸡源大肠杆菌的耐药性研究［J］.广东农业科学，2011，（2）：124-125.

［2］苟清碧.鸭源致病性大肠杆菌耐药性研究.西南大学硕士学位论文，2008：5.

S852.61＋2

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：1004-5090（2017）01-0003-03

2016-10-13）