张 姝, 徐志珍, 夏 玮, 杜永芹, 张黎伟, 张文清

(1.华东理工大学化学与分子工程学院,上海 200237; 2.上海市嘉定蜡梅研究所,上海 201805;3.云南林缘香料有限公司,云南 651107)

基于多种模式识别方法的不同品种蜡梅挥发油的成分分析及抗氧化活性测定

张 姝1, 徐志珍1, 夏 玮1, 杜永芹2, 张黎伟3, 张文清1

(1.华东理工大学化学与分子工程学院,上海 200237; 2.上海市嘉定蜡梅研究所,上海 201805;3.云南林缘香料有限公司,云南 651107)

研究了不同品种蜡梅花挥发油的成分及抗氧化活性。采用气质联用和多种模式识别方法,对不同品种蜡梅的挥发油进行了成分分析和分类结果可视化。共鉴定出62种化学成分,并筛选出22种造成不同种类挥发油差异的主要物质。此外,进行了新旧品种之间的对比,筛选出新品种中含量较高的活性物质(-)-反式石竹烯。抗氧化实验表明蜡梅挥发油可作为天然抗氧化剂,且新品种挥发油的抗氧化性在多种体系中显著优于其他品种,说明该品种具有较高的培育价值。

蜡梅; 挥发油; 模式识别; 抗氧化活性

植物代谢组学是代谢组学的一个重要分支,主要是对植物的某一组织或细胞在特定生理时期内所有低相对分子质量代谢产物[1],或者不同物种、不同基因类型或不同生态类型的植物的所有小分子代谢产物[2-3]同时进行定性和定量分析。目前,普遍应用于植物代谢组学中的技术有NMR、GC-MS和LC-MS等[4]。为了充分挖掘所获得数据中的潜在信息,主要可以采用模式识别的手段,包括非监督(Unsupervised)的方法和有监督(Supervised)的方法。主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)是一种常用的非监督性学习方法,通过简化和降维技术,将数据信息转化为能体现生物变化的某个空间位置,从而实现可视化分析[5]。其不考虑样品的分类信息,通过对高维数据进行降维后,对样品直接进行判断[6],因此分组最为客观。为了进一步放大组间差异,则采用有监督的方法,最常见的是偏最小二乘判别分析(Partial Least Squares Projection to Latent Structures-Discriminant Analysis,PLS-DA)和正交最小偏二乘判别分析(Orthogonal PLS-DA,OPLS-DA)。它们可以更好地描绘不同样本之间的区别,并筛选造成差异的物质。

蜡梅(Chimonanthuspraecox(Linn.) Link)为蜡梅科蜡梅属落叶灌木,是我国特有的传统观赏型植物，具有一定的药用价值,如止咳化痰、抗炎解热、降压、免疫增强等作用[7]。本研究借鉴植物代谢组学的思路,采用了多种模式识别手段,对3种不同品种蜡梅的挥发油进行了成分分析及分类可视化,并对其抗氧化活性进行了测定和比较,为蜡梅的研究和开发提供了理论依据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

芳樟醇、β-榄香烯、(-)-反式石竹烯、橙花叔醇、2,2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH)、2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 二铵盐(ABTS)、氯化铁(Ⅲ)六水合物、硫酸亚铁水合物、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(TPTZ)、β-胡萝卜素、亚油酸和吐温40均购自Sigma-Aldrich,其他试剂均为国产分析纯。

中药粉碎机(WKZ-4型,山东青州市精诚医药装备制造有限公司),分析天平(METTLER AE24,METTLER TOLEDO),气质联用仪(QP2010PLUS,SHIMADZU),紫外可见分光光度计(UV2550,SHIMADZU)。

1.2 材 料

蜡梅样品于2016年1月采自上海市嘉定区外冈蜡梅基地,经嘉定蜡梅研究所杜永芹研究员鉴定为蜡梅(Chimonanthuspraecox(Linn.) Link)的花瓣,留存样品于课题组样品室。样品共包含3种品种,其中古蜡梅(CP-1)为新品种,花蝴蝶(CP-2)和扬州黄(CP-3)为旧品种。每个品种共采集3份样品。

1.3 实验方法

1.3.1 3种蜡梅挥发油的提取 蜡梅花样品经粉碎后过60目筛(孔径250 μm)。称取粉碎后的样品100 g,置于Clevenger式装置中,使用质量分数为2%的NaCl溶液,水蒸气蒸馏3 h,收集挥发油。得到的挥发油使用无水乙醚萃取,并使用无水硫酸钠干燥。挥发除乙醚,即得到蜡梅花挥发油。3种挥发油分别避光储存在棕色试剂瓶内,放入-18 ℃冰箱冷藏备用。

1.3.2 GC-MS分析条件 GC条件:Rtx-5毛细管柱(30 mm×0.25 mm,0.25 μm)。升温程序:初始温度为60 ℃,以3 ℃/min升至280 ℃,保持5 min。载气为高纯氦气,流量控制方式为线速度,柱流量为1.00 mL/min,分流比50∶1,进样量为5 μL。

MS条件:离子源为EI源,离子源温度为230 ℃,接口温度为280 ℃,溶剂延迟时间2 min,扫描范围为35～500 mAu。

定性方法:所得到的化合物谱图与工作站自带的NIST质谱库进行匹配鉴定,部分物质在NIST质谱库鉴定结果基础上使用现有标准品进行进一步确认。

1.3.3 数据提取与多元统计分析 将气质联用鉴定出来的各物质的名称、保留时间和相对含量保存于excel文件中,形成三维数据矩阵,并将其导入多变量统计软件SIMCA-P(Version 13.0,Umertrics,Sweden),对数据集进行数据标准化处理。在统计分析前,对数据进行了对数转换和标准化处理(中心化后统一到单位方差)。

非监督的主成分分析(PCA)及载荷图(Loadings plot)直观地判断3种挥发油是否存在差异;有监督的偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)进一步分析三组样本之间的聚集和分离关系;最后利用有监督的正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)建立新旧品种之间的区分模型,并结合PLS-DA结果筛选造成品种间差异的物质。

1.3.4 DPPH自由基清除能力的测定 根据文献[8]方法,配制浓度为0.1 mmol/L的DPPH自由基溶液。分别将不同浓度的1 500 μL挥发油-甲醇溶液与1 500 μL的DPPH自由基溶液混合,充分震荡混合液,室温下避光反应30 min。用紫外-可见分光光度计测定反应液在波长517 nm处的吸光度,以甲醇作为参比,并以不含被测蜡梅挥发油的甲醇溶液作为空白对照物。计算清除率并作图,从图中读出IC50值(半数清除浓度)。IC50越小,抗氧化活性越好。清除率根据下列公式计算:

其中,Ai是样品溶液的吸光度;A0是不含被测蜡梅挥发油的甲醇溶液的吸光度。

1.3.5 ABTS阳离子自由基清除能力的测定 参照文献方法[9]配制7.0 mmol/L的ABTS水溶液与等量的过硫酸钾水溶液(2.45 mmol/L),并充分混合,混合液在室温条件下避光放置反应12～16 h,得到含有ABTS阳离子自由基的原液。测试前,使用无水甲醇将原液稀释至其在波长734 nm处的吸光度为0.700±0.050,即为工作液。

测试时,分别将300 μL不同浓度的挥发油甲醇溶液,与2 700 μL工作液混合,振荡均匀后室温条件下避光反应10 min。用紫外-可见分光光度计测定反应液在波长734 nm处的吸光度,以甲醇作为参比,并以不含被测蜡梅挥发油的甲醇溶液作为空白对照物。计算清除率并作图,从图中读出IC50值。ABTS阳离子自由基的清除率的计算同DPPH法。

1.3.6β-胡萝卜素漂白法抗氧化活性的测定 参照文献[10],0.5 mgβ-胡萝卜素溶解在1 mL氯仿中,然后加入200 mg吐温-40和25 μL亚油酸,在40 ℃下减压蒸馏除去氯仿。缓慢加入100 mL双蒸水,剧烈摇匀,得到的乳浊液即为β-胡萝卜素-亚油酸溶液。取2.5 mL的β-胡萝卜素-亚油酸溶液和0.5 mL挥发油甲醇溶液,充分混合。采用紫外分光光度计在470 nm波长处测其吸光度,然后在50 ℃的水浴下反应2 h,再次测定其在470 nm波长处的吸光度。抑制率根据下列公式计算:

其中,A0是2 h后样品溶液的吸光度;Ai是初始样品溶液的吸光度。实验结果以IC50表示。

1.3.7 铁还原法(FRAP)抗氧化活性的测定 参照文献[11]制备FRAP工作液,参照文献[12]绘制硫酸亚铁标准曲线。分别配制质量浓度为5 mg/mL的挥发油-甲醇溶液,取50 μL于5 mL容量瓶中,使用现配好的FRAP工作液定容。将上述溶液置于37 ℃水浴中反应10 min后,在593 nm处测定吸光度。总抗氧化能力可在硫酸亚铁标准曲线中查出相应的值。样品的抗氧化结果以FRAP值表示,即每毫克样品相当于硫酸亚铁的摩尔浓度,FRAP值越大,抗氧化能力越强。

1.3.8 统计学分析 抗氧化实验均设定3组重复,实验结果以平均值±标准偏差表示。实验结果使用统计学软件SPSS(Version 19,IBM,USA)进行统计分析。多组比较采用单因素方差分析法(One-Way ANOVA),运用Duncan法进行两两比较。P<0.05的差异具有统计学意义。不同显著性水平采用以下方法表示:*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。

2 结果与讨论

2.1 不同品种蜡梅挥发油的成分鉴定

3种蜡梅花挥发油(CP-1,CP-2,CP-3)中的化学成分经GC-MS检测得到的总离子流如图1所示。根据NIST质谱数据库检测结果,共鉴定出62种化合物,其保留时间、分子式及中英文名称见表1。

由表1可知,3种蜡梅挥发油共鉴定出62种物质,包括萜烯类31种,醇类14种,酚酸类2种,醛类4种,烷烃类7种,酰胺类2种和酯类2种。

2.2 不同品种蜡梅挥发油的多元统计分析及差异性研究

2.2.1 PCA分析 初步观察图1中的3张总离子流图,可以发现不同品种蜡梅花的挥发油中各物质含量存在着一定的差异。为了使分析结果更加直观可靠,且具有统计学意义,首先采用了非监督的PCA方法。PCA一维得分图见图2(a),载荷图见图2(b)。3个品种的样本分别聚成一类,完全分离,说明不同品种蜡梅花的挥发油存在差异。此外,主成分分析载荷图为初步确定化合物的含量差异提供了帮助。如图2(b)所示,载荷图上每个点代表一个变量,离原点距离越远,表明该成分含量变化对分类的贡献越大。

2.2.2 PLS-DA分析 PLS-DA为有监督性分析,可减少组内差异,并和PCA分析相互验证,进一步筛选造成分类的差异变量。PLS-DA一级得分图见图3。其代表模型稳定性的累积Q2X值达到了0.916,代表模型预测能力的累积Q2Y值达到了0.995,表明所建立的模型具有高度的稳定性和预测能力。

图1 3种蜡梅挥发油的总离子流图

图2 PCA一维得分图(a)及载荷图(b)

No．tR/minElementalcompositionIdentifiedcompoundsw/%CP⁃1CP⁃2CP⁃316．325C10H16β⁃Phellandrene00．48028．595C10H16(Z)⁃β⁃ocimene0．310．400．503∗10．570C10H18OLinalool0．090．490410．745C9H18O1⁃Nonanal0．270．260．44520．355C10H16δ⁃Elemene0．530．480．51622．055C15H24(⁃)⁃α⁃Cubebene0．950．591．007∗22．720C15H24β⁃Elemene6．464．635．478∗23．980C15H24(⁃)⁃β⁃Caryophyllene9．052．666．78924．300C15H242⁃Isopropenyl⁃1⁃methyl⁃4⁃(1⁃methylethylidene)⁃1⁃vinylcyclohexane0．810．480．561024．535C15H24(+)⁃γ⁃Gurjunene0．440．360．361125．335C15H24α⁃Caryophyllene2．651．101．711226．020C15H24(+)⁃δ⁃Cadinene0．690．610．511326．180C15H241⁃Isopropyl⁃4，7⁃dimethyl⁃1，2，4a，5，6，8a⁃hexahydronaphthalene/isomer0．620．460．391426．455C15H24(⁃)⁃γ⁃Cadinene7．546．469．601526．690C15H24α⁃Guaiene0．560．540．161626．890C15H24α⁃Farnesene2．3901．241727．035C15H24γ⁃Elemene/isomer5．577．552．381827．130C15H24α⁃Muurolene0．5801．57

续表1

*Compound confirmed by authentic standard

图3 PLS-DA一维3D得分图

为了帮助选择贡献较大的差异组分,变量权重重要性排序(Variable Importance in Projection,VIP)值被作为多维模型差异元素选择的指标。VIP值越大,该成分在不同品种挥发油中的差异越显著。按照经验值,VIP值大于1的组分即为多维模型的贡献变量。其中,VIP值大于1.5的组分可被标记为极显著的贡献变量。各贡献变量的序号和VIP值见表2,共22种。这些物质即为造成不同种类挥发油差异的主要物质。

2.2.3 OPLS-DA分析 PLS-DA常用来评估多组数据是否具有显著性差异,如需要放大对比两组数据的差异,可采用OPLS-DA 分析方法。这种方法不仅能评估两组间是否有显著性差异,还能进一步找出具体造成这些差异的组分[13]。在本工作中,如1.2节所提到的,3个品种中CP-1为新品种,CP-2和CP-3为旧品种。为了考察新旧品种间的差异,将CP-1分别与CP-2和CP-3进行了OPLS-DA分析。结果见图4和图5。

表2 各贡献变量的VIP值

图4 CP-1和CP-2的OPLS-DA得分图(a)以及CP-1和CP-2在OPLS-DA模式下的S-Plots载荷图(b)

图5 CP-1和CP-3的OPLS-DA得分图(a)以及CP-1和CP-3 在OPLS-DA模式下的S-Plots载荷图(b)

在OPLS-DA得分图中,两组样品均可以完全分开,表示新旧品种之间存在着明显的差异。两次建模的Q2X和Q2Y值分别为0.965、1和0.940、1,显示模型的稳定性和可靠性良好。

对于分开两组的具有贡献的成分,可在相应的S-plots载荷图中来寻找。x轴表示可变量,数据点距原点越远,说明该点对样本差异的贡献越大;y轴表示样本间的相关性,数据点距离原点越远,则样本间的相关性越好。因此,图中S形状曲线两端的数据即代表了造成组间差异的可信度最高的成分[14]。此外,S-plots载荷图可与OPLS-DA得分图相对应,即S曲线左侧的数据对应了CP-1中含量远远高于其他品种的主要成分。

由图4(b)和图5(b)所示,新品种CP-1和旧品种CP-2相比,含量明显较高的主要成分为8号((-)-β-caryophyllene) 和31号((1aR,4S,4aS,7R,7aS,7bS)-1,1,4,7-Tetramethyldecahydro-1H-cyclopropa[e]azulen-4-ol) 物质,CP-1和旧品种CP-3相比,含量明显较高的主要成分是17号(γ-Elemene)、41号((+)-Cedrol)和8号物质。可以发现,新品种挥发油中8号物质的含量远远高于两个旧品种,将其相对含量分布以箱式图的形式直观地表示出来,见图6。

表1中,8号物质通过NIST质谱库检索,并加以标准品验证,被鉴定为(-)-β-caryophyllene,即(-)-反式石竹烯。(-)-反式石竹烯是一种主要的挥发油香气成分[15],并具有较高的生物活性,如抗癌[16]、抗细菌病原体[17]、体内抗氧化[18]等。其在CP-1中的高含量,表明了该新品种具有较高的培育价值。

图6 8号物质在3种挥发油中相对含量分布箱式图

2.3 不同品种的蜡梅挥发油抗氧化活性

3种挥发油的抗氧化活性实验结果见图7。

Data are the mean of three independent analyses of each representative variety(mean ± SD;n=3);nd means couldn’t detect activities; * indicates significant differences at P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001

3种挥发油均有一定的抗氧化活性,可以作为天然抗氧化剂。在DPPH自由基清除实验中,CP-1活性最好,其IC50为(2.390±0.079)mg/mL,显著地高于其他2种挥发油(P<0.05);在ABTS阳离子自由基清除实验中,CP-3(IC50为(0.116±0.003)mg/mL)则远远地优于其他挥发油(P<0.001);而在β-胡萝卜素漂白实验中,3种挥发油的活性差异较为明显,活性最好的为CP-1,IC50达到了(0.173±0.008)mg/mL(P<0.01)。FRAP法可以衡量整体的抗氧化活性,FRAP值越大则活性越强。在3种挥发油中,CP-1的FRAP值为(26.613±0.09)μmol/(L·mg),显著地高于CP-2和CP-3(P<0.001)。因此,可以发现,新品种蜡梅的挥发油(CP-1)的抗氧化活性在多种体系中明显优于旧品种。

3 结 论

通过气质联用及多种模式识别手段,共鉴定出62种蜡梅挥发油的主要成分,并通过PCA和PLS-DA等手段直观地提供了不同种类挥发油的分类信息,并发现了22种造成挥发油差异的主要物质,实现了其成分信息的可视化。此外,通过OPLS-DA进行新旧品种之间的两两分析,发现活性物质(-)-反式石竹烯在新品种挥发油中的含量显著性地高于旧品种。

在4种抗氧化体系下,3种挥发油均有较好的抗氧化活性,因此蜡梅挥发油可以作为天然的抗氧化剂。新品种挥发油在多种抗氧化体系中活性显著地高于旧品种,表明该品种具有较高的培育价值。

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Analysis and Antioxidant Activities of Volatile Oil from Different Varieties ofChimonanthusPraecoxBased on Multiple Pattern Recognition

ZHANG Shu1, XU Zhi-zhen1, XIA Wei1, DU Yong-qin2, ZHANG Li-wei3, ZHANG Wen-qing1

(1.School of Chemistry and Molecular Engineering,East China University of Science and Technology, Shanghai 200237,China; 2.Research Base of Chimonanthus Praecox,Jiading,Shanghai 201805,China; 3.Yunan Linyuan Spices Co. Ltd,Kunming 651107,China)

In this research,comprehensive phytochemical profile and antioxidant activities of volatile oil isolated from different varieties ofChimonanthuspraecoxwere studied.The chemical composition of volatile oil was analyzed using gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS) method,and visualization of classification in different varieties was carried out based on multiple pattern recognition methods.A total of 62 compounds were identified and 22 main markers responsible for discrimination among different varieties were indicated.In addition,the comparison among new and traditional varieties was achieved and(-)-β-caryophyllene was filtered for its higher content in new variety than traditional ones.The antioxidant assays revealed thatChimonanthusPraecoxvolatile oil was a good candidate for natural antioxidants.Moreover,the one of new variety had the significantly higher antioxidant activities than the traditional ones in various systems,indicating its high cultivation value.

ChimonanthusPraecox; volatile oil; pattern recognition; antioxidant activities

1006-3080(2017)01-0076-08

10.14135/j.cnki.1006-3080.2017.01.013

2016-06-28

上海市种业发展项目(13391900500);云科合发(2014)5号

张 姝(1990-),女,辽宁抚顺人,博士生,研究方向为天然产物的分离分析。E-mail:chemistry_zhangshu@126.com

张文清,E-mail:zhwqing@ecust.edu.cn

O629.6

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