赵 莹，骆雪萍，张 雪，宋文洺

(1 桂林医学院第二附属医院，广西 桂林 541001； 2 桂林医学院，广西 桂林 541001)

·论著·

Dectin-1在热处理光滑假丝酵母菌刺激大鼠气道上皮细胞中的作用及对IL-10和TNF-α表达的影响

赵 莹1，骆雪萍1，张 雪1，宋文洺2

(1 桂林医学院第二附属医院，广西 桂林 541001； 2 桂林医学院，广西 桂林 541001)

目的 探讨树突状细胞相关C型凝集素-1(Dectin-1)在热处理光滑假丝酵母菌刺激大鼠气道上皮细胞(RTECs)中的作用及对IL-10和TNF-α表达的影响。方法 将体外培养的RTECs随机分为3组：对照组(RTECs +无菌生理盐水)、真菌刺激组(RTECs +热处理光滑假丝酵母菌)、抑制剂干预组(RTECs +昆布多糖+热处理光滑假丝酵母菌)，分别孵育0、2、4、6 h后终止，MTT法检测细胞存活率，Western Blot法检测Dectin-1表达，ELISA法检测IL-10和TNF-α的表达。结果 热处理光滑假丝酵母菌破坏细胞结构，降低细胞存活率。在培养开始时(0 h)，3组RTECs细胞存活率以及Dectin-1、IL-10、TNF-α表达水平比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。培养2、4、6 h后，真菌刺激组、抑制剂干预组Dectin-1、IL-10、TNF-α表达水平均高于对照组，抑制剂干预组Dectin-1、IL-10、TNF-α表达水平均低于真菌刺激组(均P<0.05)。除抑制剂干预组0 h与2 h IL-10表达量比较，差异无统计学意义之外，真菌刺激组和抑制剂干预组组内不同时间段Dectin-1、IL-10、TNF-α表达水平比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 Dectin-1是RTECs识别热处理光滑假丝酵母菌的重要受体，并诱导其释放IL-10和TNF-α，介导炎症反应的发生。

Dectin-1受体；热处理光滑假丝酵母菌；大鼠气道上皮细胞；昆布多糖； IL-10；TNF-α

[Chin J Infect Control，2017，16(1)：10-15]

侵袭性肺部真菌感染(invasive pulmonary fungal infection，IPFI)是目前重症监护病房重要的感染性疾病之一。近年来，光滑假丝酵母菌检出率明显增高，某些地区或医院光滑假丝酵母菌已成为仅次于白假丝酵母菌的第2位或第3位常见病原假丝酵母菌[1-2]。气道上皮细胞表达的树突状细胞相关C型凝集素-1(Dectin-1)是真菌细胞壁β-葡聚糖的重要识别受体，在机体抵抗真菌感染中发挥着重要作用。本实验通过建立体外热处理光滑假丝酵母菌刺激大鼠气道上皮细胞(rat tracheal epithelia cells，RTECs)模型，观察细胞形态和数目、细胞存活率、细胞Dectin-1表达和细胞因子IL-10、TNF-α表达，探讨Dectin-1受体在光滑假丝酵母菌中的作用，为侵袭性真菌感染的治疗提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料 RTECs购自北京协和细胞资源中心，光滑假丝酵母菌菌株购于上海酶联生物科技有限公司，Dectin-1受体抑制剂昆布多糖、MTT粉、细胞冻存液DMSO(二甲基亚砜)购自Sigma公司，DMEN/F12(1∶1) 培养基、胎牛血清、青链霉素均购自Gibco公司，兔抗鼠Dectin-1抗体(一抗)、兔抗鼠β-actin抗体(一抗)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体(二抗)均购自北京中杉金桥生物技术公司，BCA定量试剂盒、RIPA裂解液购自碧云天公司，IL-10和TNF-α ELISA试剂盒购于eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 RTECs体外培养 RTECs按5×105/孔接种于六孔板中，用DMEN/F12(1∶1)培养基(加入10%胎牛血清和10%青链霉素)于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。常规进行培养、传代等操作。

1.2.2 光滑假丝酵母菌混悬液的制备 将光滑假丝酵母菌接种于沙堡琼脂培养基，37 ℃培养48 h；挑取菌落后用无菌生理盐水冲洗2遍，在浊度仪上

使用生理盐水稀释至菌液浓度为1×107CFU/mL；按照文献方法进行热处理[3]：在95℃环境中进行水浴热处理30 min，冷却后妥善贮存、备用。

1.2.3 建立热处理光滑假丝酵母菌感染RTECs模型 将培养好的RTECs接种于10 cm2的培养皿中，随机分为3组：对照组为RTECs+无菌生理盐水；真菌刺激组为RTECs+热处理光滑假丝酵母菌，调整浓度使感染复数(MOI)=1；抑制剂干预组为RTECs+昆布多糖+热处理光滑假丝酵母菌，加入Dectin-1特异性抑制剂昆布多糖，使其终浓度为0.3 mg/mL，预处理30 min后加入热处理光滑假丝酵母菌菌液[4]。3组在处理完后放入37℃恒温细胞培养箱内培养，0、2、4、6 h后终止孵育，分别行MTT法、Western Blot方法和ELISA方法检测。

1.2.4 MTT法检测RTECs细胞存活率 每孔加入浓度为5 mg/mL的MTT溶液20 μL，在37℃培养箱中孵育4 h后弃去上清液，每孔加入150 μL DMSO，避光振荡20 min后，使用酶标仪在490 nm波长处检测每孔吸光度值(A)。

1.2.5 Western Blot方法检测Dectin-1蛋白表达 分别收集3组细胞，用含磷酸酶抑制剂甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液提取蛋白，应用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。用10%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳，PVDF膜湿转，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，ECL显色观察，应用X线胶片曝光，在电脑上使用Image J软件进行分析并计算各条带灰度值。

1.2.6 ELISA方法检测IL-10、TNF-α表达 取3组细胞的上清液样本各100 μL，严格按照IL-10、TNF-α试剂盒说明书步骤操作，检测样品中IL-10、TNF-α的表达水平，每个样品设2个复孔，得到的样品浓度以pg/mL表示。

1.3 统计分析 应用SPSS 18.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，采用重复测量资料方差分析，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RTECs细胞形态 光镜下观察3组RTECs形态及数目，对照组在培养2、4、6 h后细胞形态均为近梭形，形态正常，边缘清晰，未见明显细胞碎片。真菌刺激组与抑制剂干预组在培养2、4、6 h后细胞形态改变，结构变化明显，细胞呈大片坏死，可见大量细胞碎片悬浮在上清液中，随孵育时间延长，形态变化越明显，细胞碎片越多；同时间点上抑制剂干预组细胞形态变异比真菌刺激组明显，细胞损伤及死亡数目增多。见图1。

2.2 MTT实验结果 在培养开始时(0 h)，3组RTECs存活率比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。培养2、4、6 h后，真菌刺激组、抑制剂干预组RTECs存活率均低于对照组(均P<0.05)；抑制剂干预组RTECs存活率均低于真菌刺激组(均P<0.05)。真菌刺激组、抑制剂干预组组内不同时间点RTECs存活率分别比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

2.3 Western Blot方法检测细胞Dectin-1蛋白表达 在培养开始时(0 h)，3组RTECs Dectin-1蛋白表达比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。培养2、4、6 h后，真菌刺激组、抑制剂干预组RTECs Dectin-1表达量均高于对照组(均P<0.05)；抑制剂干预组RTECs Dectin-1表达量均低于真菌刺激组(均P<0.05)。真菌刺激组和抑制剂干预组组内不同时间点RTECs Dectin-1表达量比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。详见图2、表2。

A1—3：对照组细胞培养2、4、6 h；B1—3：真菌刺激组细胞培养2、4、6 h；C1—3：抑制剂干预组细胞培养2、4、6 h

组别0h2h4h6h真菌刺激组(n=6)102.68±3.8991.04±3.04*▲81.77±2.44*▲75.87±2.21*▲抑制剂干预组(n=6)99.90±3.4584.83±2.07*△▲73.78±1.08*△▲63.28±1.94*△▲对照组(n=6)100.00±1.49103.26±2.87107.18±4.33109.35±4.54

*：与对照组同时间点比较P<0.01；△：真菌刺激组同时间点比较P<0.01；▲：与同组前一时间点比较P<0.01

2.4 ELISA法检测IL-10、TNF-α的表达 在培养开始时(0 h)，3组RTECs IL-10、TNF-α表达量比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。培养2、4、6 h后，真菌刺激组、抑制剂干预组RTECs IL-10、TNF-α表达量均高于对照组(均P<0.05)；抑制剂干预组RTECs IL-10、TNF-α表达量均低于真菌刺激组(均P<0.05)。真菌刺激组组内不同时间点细胞IL-10、TNF-α表达量比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。抑制剂干预组组内不同时间点细胞IL-10(2 h与4 h、4 h与6 h)、TNF-α(0 h与2 h、2 h与4 h、4 h与6 h)表达量比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表3。

图2 不同时间点3组RTECs Dectin-1蛋白的表达情况

Figure 2 Expression of RTECs Dectin-1 protein of three groups at different time points

表2 不同时间点3组RTECs Dectin-1蛋白的相对表达量

*：与对照组同时间点比较P<0.01；△：与真菌刺激组同时间点比较P<0.01；▲：与同组前一时间点比较P<0.05

表3 不同时间点3组RTECs IL-10、TNF-α分泌情况

*：与对照组同时间点比较P<0.01；△：与真菌刺激组同时间点比较P<0.01；▲：与同组前一时间点比较P<0.05

3 讨论

光滑假丝酵母菌是严重危害患者生命安全的重要机会致病菌，尤其对重症监护病房的患者更为明显。侵袭性肺部真菌感染中，气道上皮细胞首先接触病原真菌，成为机体抵御外界刺激的第一道屏障。研究[5]表明，上皮细胞具有重要的免疫防御功能，其模式识别受体可以在受到外界刺激或损伤时分泌不同的宿主防御蛋白。Dectin-1是一种可以识别真菌的重要模式识别受体，在真菌炎症反应中起重要的调节作用；Dectin-1与真菌细胞壁的β-1,3葡聚糖结合后形成“吞噬突出”激活，经免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)募集激活酪氨酸激酶(SyK)，诱导生成 CARD9-Bcl10-Malt1 (CBM)复合物激活下游信号通路，调节多种细胞因子和趋化因子的产生[6-7]，在真菌的识别和天然免疫反应中起重要作用。研究[8-9]发现，气道上皮细胞能在光滑假丝酵母菌感染后上调Dectin-1的表达。本实验用RTECs成功建立体外光滑假丝酵母菌感染模型，光镜下可见真菌刺激组和抑制剂干预组细胞成片坏死、变形、破碎；MTT实验显示，光滑假丝酵母菌菌液对细胞生长具有明显的抑制作用。RTECs在与热处理光滑假丝酵母菌共培养后可表现出Dectin-1表达水平的上调。

昆布多糖是一种萃取于掌状海带的1,3-β-葡聚糖，可以特异性结合Dectin-1，是Dectin-1的特异性阻断剂[10]。在小鼠白假丝酵母菌感染模型中，Dectin-1基因敲除小鼠对白假丝酵母菌的抵抗能力下降[11]；Elcombe等[12]研究发现，Dectin-1与IL-10等细胞因子的表达有关。本实验中，热处理光滑假丝酵母菌诱导细胞IL-10和TNF-α的高表达，相比真菌刺激组，抑制剂干预组IL-10和TNF-α的表达水平明显降低，提示Dectin-1可参与光滑假丝酵母菌的识别并诱导细胞因子IL-10和TNF-α的产生，实验结果与林莉等[13]研究结果一致。与单纯热处理光滑假丝酵母菌刺激的RTECs相比，昆布多糖刺激后，不仅表现为Dectin-1的表达显著下降，IL-10、TNF-α的表达也呈同样的变化趋势，与Sun等[9]的结果相似。抑制剂干预组细胞因子表达虽然比真菌刺激组低，但仍高于正常对照组，提示在光滑假丝酵母菌引起的真菌感染中，还有其他的模式识别受体和信号转导通路共同参与抗真菌感染的免疫反应。

病原真菌侵入机体后启动固有免疫系统，炎性细胞浸润，其中辅助性T(T helpers, Th)细胞起重要作用。TNF-α是Th1型细胞因子，可以增强免疫细胞对假丝酵母菌的抵抗作用，对机体起保护作用；IL-10是Th2型细胞因子，具有抗炎和免疫抑制作用，被称为细胞因子合成阻抑因子。机体正常情况下可少量表达IL-10、TNF-α等细胞因子，在病原菌入侵激活病原模式识别受体启动炎症反应时，上述细胞因子的表达出现变化。Dectin-1的缺乏可以抑制保护性免疫的发展，减少Th1、Th2和Th17型细胞因子的产生，减少活化的CD4+和CD8+迁移至感染部位，导致更加严重的组织病理学变化和病死率[14]。本实验中，热处理光滑假丝酵母菌刺激RTECs可以诱导IL-10和TNF-α的表达，昆布多糖可以部分抑制这种作用。随着孵育时间的延长，细胞存活率减低，细胞产生IL-10和TNF-α的水平进行性增高，提示上述细胞因子可能在热处理光滑假丝酵母菌刺激RTECs中起负性调节作用，与本课题组前期动物实验结果[15]一致。

综上所述，本实验发现热处理的光滑假丝酵母菌可以刺激体外培养的RTECs Dectin-1表达上调，并诱导产生IL-10和TNF-α，这些细胞因子可能趋化炎性细胞因子至感染部位，介导抗真菌免疫反应。抑制剂干预组阻断Dectin-1受体后可抑制其介导产生的细胞因子表达水平，提示可以将Dectin-1作为调节靶点，调控其表达来控制炎症反应强度，以减少对机体的损伤，控制炎症范围，更好地治疗侵袭性真菌感染。本实验为体外细胞试验，可直接表现出RTECs对真菌感染的反应，由于动物机体内部自环境的复杂、个体的差异性等原因，细胞试验并不能完全说明机体内真正的信号转导过程和炎症调节机制，但可能为今后以Dectin-1为靶点的侵袭性真菌感染的治疗和相关药物的研发提供新思路和实验室依据。

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(本文编辑：刘思娣)

Role of Dectin-1 in the production of IL-10 and TNF-α by rat tracheal epithelial cells stimulated with heat-treatedCandidaglabrata

ZHAOYing1,LUOXue-ping1,ZHANGXue1,SONGWen-ming2

(1TheSecondAffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin541001,China; 2GuilinMedicalUniversity,Guilin541001,China)

Objective To investigate the effect of Dectin-1 on the release of inflammatory factors interleukin-10(IL-10) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in rat tracheal epithelial cells (RTECs) stimulated with heat-treatedCandidaglabrata(C.glabrata).Methods RTECs cultivated in vitro were randomly divided into three groups, including control group(RTECs +sterile normal saline), fungal stimulation group(RTECs + heat-treatedC.glabrata), and inhibitor intervention group(RTECs + laminarin + heat-treatedC.glabrata), cells were harvested after incubation for 0, 2, 4, 6 hours respectively, cell survival rate was determined by MTT method, expression of Dectin-1 was analyzed by Western Blot, expression of IL-10 and TNF-α were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Results Heat-treatedC.glabratadestroyed cell structure and reduced cell survival rate. At the beginning of the culture (0 h), cell survival rate, expressions of Dectin-1, IL-10 and TNF-α among three groups were all not significantly different(allP>0.05). After incubation for 2, 4, 6 hours, expressions of Dectin-1, IL-10 and TNF-α in fungal stimulation group and inhibitor intervention group were both significantly higher than control group; expressions of Dectin-1, IL-10,and TNF-α in inhibitor intervention group was lower than fungal stimulation group(allP<0.05). The expressions of IL-10 in inhibitor intervention group at 0 h and 2 h was not significantly different, expressions of Dectin-1, IL-10, and TNF-α in fungal stimulation group and inhibitor intervention group at different incubation periods were significantly different(allP<0.05).Conclusion Dectin-1 is an important receptor for RTECs to recognize the heat-treatedC.glabrata, it induces the release of IL-10 and TNF-α, and mediate the occurrence of inflammation.

Dectin-1 receptor; heat-treatedCandidaglabrata; rat tracheal epithelial cell; laminarin; IL-10; TNF-α

2016-07-12

广西自然科学基金资助项目(2013GXNSFAA019209);广西医疗卫生重点科研课题(重2012007)

赵莹(1991-)，女(回族)，河南省郏县人，硕士研究生，主要从事重症感染研究。

骆雪萍 E-mail：xueping-l@sohu.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.01.003

R519.3

A

1671-9638(2017)01-0010-06