李丽萍，屈晨雪，戴菊华，吴雪莲

(北京大学第一医院检验科，北京 100034)

·综述·

血小板糖基化的研究进展

李丽萍，屈晨雪，戴菊华，吴雪莲

(北京大学第一医院检验科，北京 100034)

糖基化是蛋白质翻译后修饰的重要途径之一。通过调节蛋白质活性，糖基化参与细胞功能的发挥及疾病的发生发展。血小板糖蛋白具有丰富的糖萼，其糖基化在血小板生成、分化中发挥重要作用，与出血及血栓性疾病的发病机制密切相关，多个糖蛋白分子，如P选择素、C型凝集素样受体2、血小板内皮细胞黏附分子等的糖基化修饰均参与调控血小板的功能。该文主要综述了血小板糖基化在出血及血栓性疾病中的研究进展及主要检测方法。

血小板；糖蛋白；糖基化

糖基化是体内最重要的蛋白质翻译后修饰之一。在酶的催化下糖链与肽链上的特定糖基化位点结合，或糖基之间生成糖苷键而发生共价结合,该过程称为蛋白质糖基化。糖基化在蛋白质的折叠、相互作用、稳定性、流动性及信号转导中均具有重要作用。糖蛋白糖链主要分为天冬酰胺连接的N-糖链和丝氨酸或苏氨酸连接的O-糖链2大类。糖链主要有9种糖基，包括半乳糖、甘露糖、葡萄糖、岩藻糖、木糖、N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰氨基半乳糖、葡萄糖醛酸、唾液酸，在高尔基体及内质网内糖基转移酶调节下依次延伸合成数百种不同的糖链结构[1]。通过调节蛋白质活性，糖基化也参与维持细胞的正常功能以及疾病的发生、发展过程[2]。研究证实，糖蛋白的糖基化水平或糖链结构在许多疾病的发生、发展过程中均发生了改变，导致糖蛋白及其所在细胞的功能障碍，例如癌症、炎症反应、自身免疫病等。目前超过50%的蛋白质有糖基化，而现有数据库中只有约10%注释为糖蛋白。电子显微镜下显示血小板表面含有丰富的糖蛋白，形成了丰富的糖萼，在其分化、发育及功能方面可能发挥重要作用。本综述主要总结血小板糖基化的研究进展及其主要检测方法。

1 血小板糖基化与疾病

1.1血小板糖基化与出血性疾病 原发性免疫性血小板减少症(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)是一种免疫性血小板破坏过多造成的出血性疾病。目前公认的血小板清除机制是Fc受体途径介导的血小板破坏：抗血小板抗体与血小板膜糖蛋白结合，如糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(glycoprotein Ⅱb/Ⅲa,GPⅡb/Ⅲa)、糖蛋白Ⅰb(glycoproteinⅠb,GPⅠb)等，使血小板被单核-巨噬细胞吞噬。陶莉莉等[3]分析ITP患者血小板糖基化程度与一线治疗疗效相关性，发现血小板糖基化水平可在一定程度上提示ITP患者治疗效果，表明ITP患者血小板清除可能存在非Fcγ依赖途径。提示血小板糖基化有助于诠释部分难治性ITP的发病机制，为其治疗提供新的思路。

3例遗传性唾液酸缺陷患者临床表现为出血，血小板减少，同时平均血小板体积增大[4]。其血小板GPⅠb表达水平正常，但十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)电泳却显示GPⅠb移动速率减慢，且与GPⅠb结合的花生凝集素含量减少，说明唾液酸含量减低。可见GPⅠb的唾液酸化水平在血小板的正常分化发育及功能发挥中产生一定的影响。

1.2血小板糖基化与血栓性疾病 先天性糖基化障碍(congenital disorder of glycosylation，CDG)疾病由于磷酸甘露糖酶(PMM2)发生突变，导致N-糖链糖基化异常。此类患者由于血小板自发聚集而导致血栓风险增加，而血小板糖蛋白潜在的低糖基化可能是导致血小板反应亢进的原因。而血小板N-糖链的糖蛋白(包括GPⅠbα)在数量和质量上均没有明显变化，但血小板的半乳糖糖基化水平升高。提示血小板表面糖蛋白的异常糖基化修饰可能导致血小板自发性聚集造成血小板高反应性[5]。

冠状动脉粥样硬化斑块破裂导致血栓形成是冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease,CHD)的病理生理基础，血小板则参与血栓形成，在CHD的发生发展中发挥重要作用。CHD患者血管内皮细胞功能紊乱，血小板GPⅡb/Ⅲa和CD62P表达增高，呈现高反应性，发生血栓风险增加[6]。周方元等[7]发现CHD患者中血清唾液酸水平明显高于对照组，高水平的唾液酸可能通过炎症反应、促进白色血栓形成等方式加速动脉粥样硬化的进程。血小板膜表面GPⅠb是糖基化程度最高的唾液酸糖蛋白，其唾液酸含量占血小板膜表面糖含量的64%。同时，动脉粥样斑块破裂暴露内皮细胞后，血小板GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ与血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)的结合是血小板活化和血栓形成的启始和关键步骤。提示CHD患者血小板高反应性及血栓风险增加与血小板GPⅠb的糖基化水平可能存在一定的相关性。

糖尿病患者体内血小板功能亢进与高血糖有关，虽然抗血小板药物可在相当程度上抑制血小板活性，研究显示仍有部分患者出现抗血小板药物不敏感。糖尿病患者体内多种蛋白质(如胶原蛋白、血红蛋白等)在高血糖状态下均发生了非酶糖基化反应，形成糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)，影响机体正常代谢途径，如促进糖尿病患者动脉粥样硬化生成，导致内皮调节功能受损[8]，增加血小板活性，促进血小板聚集等。研究发现糖尿病患者血小板糖蛋白总的糖基化水平升高，且与患者阿司匹林不敏感相关[9]。可见血小板糖基化与病程进展及治疗可能存在某种内在联系，从血小板糖基化的角度研究糖尿病，对病情认识及发病机制方面都具有重要意义。

研究发现，去除癌细胞表面的唾液酸使其更容易被固有免疫细胞识别并消灭[10]，这可能为癌症免疫疗法提供新途径。表明血小板糖基化修饰的研究不仅为诠释疾病全新的发病机制提供依据，同时也可能是出血及血栓性疾病潜在的治疗靶点。

2 血小板糖蛋白糖基化的功能

血小板糖蛋白糖基化的异常改变可能与血小板疾病密切相关。Shah等[11]分析血小板的糖蛋白质组学，从血小板裂解后获得的1 296种肽链中鉴别出799个与N-糖链结合的糖基化位点。

2.1GPⅠb GPⅠb是血小板膜表面最丰富的糖蛋白之一，其糖基化位点主要位于α亚单位[相对分子质量(Mr)143 000],蛋白酶裂解后脱落到血浆中的GPⅠb片段包含2个部分：糖链部分(Mr 80 000)和多肽部分(含有vWF和凝血酶的结合位点，Mr 45 000)[12]。Hoffmeister等[13]研究发现以尿苷二磷酸半乳糖(uridine diphosphate-galactose,UDP-Gal)为糖基化供体，使血小板表面发生半乳糖糖基化，封闭αMβ2的识别位点，抑制巨噬细胞吞噬血小板，延长冷藏血小板的保存期限。有学者构建小鼠内皮/造血干细胞中Cosmc基因定向敲除的小鼠模型(Cosmc基因编码调节O-糖链的蛋白质)，发现该突变可导致大多数小鼠在围产期严重出血而死亡，幸存小鼠尾部出血时间显著延长并发生巨血小板减少症。该类小鼠血小板GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ分子表达减少，与vWF结合功能及活化GPⅡb/Ⅲa的功能明显减弱。提示广泛的O-糖链对于血小板的生成、糖蛋白表达及功能的正常发挥必不可少，O-糖链的改变可能导致止血异常[14]。

2.2P选择素 P选择素(也称CD62P，GMP140)是存在于血小板α颗粒膜和血管内皮细胞的糖蛋白。血小板活化后，α颗粒膜与胞膜迅速融合，使P选择素在血小板表面瞬时表达，从而介导活化血小板与白细胞的反应、促进血栓形成。研究证实，P选择素存在野生型(715Thr)和变异型(715Pro)2种形式。变异型P选择素糖基化水平降低50%，其在转染细胞表面的表达和分泌也减少，与中性粒细胞样的HL-60细胞结合降低，同时其与单核细胞的聚集体也明显低于野生型；体外及体内试验显示变异型P选择素阻碍其糖基化，形成不完整P选择素，从而减少P选择素的表达及分泌，最终影响血小板功能[15]。表明血小板P选择的糖基化修饰差异可能在炎症反应中起着一定的作用。

2.3C型凝集素样受体2(C-lectin like receptor 2，CLEC-2) CLEC-2是表达于血小板表面的受体,可识别多种配体，在血小板聚集、肿瘤转移及HIV感染中发挥重要作用。CLEC-2存在2种不同的形式：高分子量和低分子量。二者的蛋白质核心相同而糖链存在差异。研究发现,2种类型的CLEC-2在134位天冬酰胺(Asn)存在不同的糖基化形式[16]。高分子量CLEC-2在该位点有岩藻糖糖链，且形式复杂，如双触角、三触角和四触角等形式，而低分子量CLEC-2中则没有这些糖链结构[16]。

2.4血小板内皮细胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule 1，PECAM-1，即CD31) PECAM-1主要分布于血小板、单核细胞和粒细胞，是内皮细胞间相互作用的主要成分。该分子通过N端的免疫球蛋白样结构域发生相互作用，维持血管通透屏障和炎症或血栓后的内皮细胞重建。研究显示，PECAM-1功能依赖于α2,6-唾液酸。缺乏α2,6-唾液酸可下调PECAM-1的酪氨酸磷酸化和募集Src(含有蛋白酪氨酸磷酸酶2)，使细胞更易发生线粒体依赖的细胞凋亡[17]。PECAM-1糖链占其分子量的30%，这些糖链主要来自于同源结合表面的25位Asn残基；通过对该位点突变体(N25Q)试验发现，尽管该突变体在细胞相互作用处正常聚集，但在凝血酶破坏的内皮细胞屏障重建功能则显著减弱，证实包含唾液酸的糖链结构(来自25位Asn)通过稳定PECAM-1分子同源结合表面而增强了内皮细胞间的动态相互作用[18]。

2.5糖基转移酶 在蛋白质糖基化修饰过程中，糖基转移酶通过催化生成糖苷键而发挥重要作用。研究曾认为糖基转移酶是定位于高尔基体适当区室中，通过外壳蛋白Ⅰ介导进行逆向转运，且仅在其茎区域的蛋白质水解切割后才被释放和分泌[19]。血小板是无核细胞，缺乏复杂的分泌系统如高尔基体、内质网等。但已有研究显示血小板有糖基转移酶的活性，人血小板是糖基转移酶的重要携带者，血小板内部和表面存在多个不同糖基转移酶家族成员，包括α2,3-唾液酸转移酶(ST3Gal-1)、β1,4-半乳糖基转移酶(β4GalT)、α2,6-唾液酸转移酶(ST6Gal-1)等[20]。同时，血小板内部也含有丰富的糖基供体，活化后释放可溶性血小板糖基转移酶和糖基供体到细胞外，并使附近细胞糖基化。活化的人血小板与ST3GalⅣ-/-缺陷小鼠血小板孵育后，小鼠血小板表面唾液酸含量增多[21]。提示血小板活化释放的糖基转移酶具有重塑血小板表面糖链、改变细胞行为的能力，可能动态控制着血小板活化。

3 血小板糖基化的检测方法

3.1质谱法 质谱法基于糖蛋白的糖链酶解和富集基础上，可定量检测糖链丰度，既可用于分辨聚糖混合物的成分，也可作为获取糖链结构信息的工具。首先纯化并富集糖蛋白/糖肽，然后用胰蛋白酶及糖苷酶对糖肽加工处理、修饰，最后根据质谱结果并参照数据库信息分析糖链糖基化位点、糖链结构[2]。质谱法是目前公认的分析糖蛋白糖基化的方法，特别适用于分析含少量聚糖的复合混合物，但在检测血小板糖基化时，只能分析血小板裂解后提纯的糖蛋白的糖链结构及糖基化水平，无法实现完整血小板糖蛋白糖基化修饰水平检测，且质谱法前处理复杂，对技术人员要求高，成本高，耗时较长，后期处理分析困难等缺陷，并不能作为血小板糖基化检测的最佳方法。目前有研究用固相萃取含糖肽段的方法(solid phase extraction of glycosite-containing peptides，SPEG)[11]或酶化学法固相萃取获得N-糖链和含糖肽(solid phase extraction of N-linked glycans and glycositecontaining peptides，NGAG)[22]，iTRAQ标记后联用LC-MS/MS技术分析血小板糖蛋白质组学。

3.2糖微阵列技术 糖微阵列技术(糖基因芯片)是以DNA微阵列技术为基础，具有高通量和高灵敏度，可用于聚糖结构分析。该技术是将数以千计的寡糖序列以点阵形式固定在特定的基板上，并通过高通量扫描技术分析糖分子与其他生物分子间的特异性相互作用，研究聚糖在生物体中的功能和作用机制。糖微阵列技术最显著的特点是样品用量小、一次性检测样品多，可同时分析、检测和鉴别成百个样品。但是糖微阵列还处于技术开发的初级阶段，在很多方面需要进一步研究，如新的构建方法、新的表面材料和显影技术、进一步微型化、灵敏的检测技术和数据处理工具等[21,23]。

3.3基于凝集素的流式细胞分析技术 凝集素能识别糖蛋白和糖脂中，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的糖基，一种凝集素具有对某一种特异性糖基专一性结合的能力；同时凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、酶、生物素、铁蛋白及胶体金等结合而不影响其生物活性。流式细胞分析技术具有灵敏度、特异性高，重复性好，分析细胞数量多(≥10 000个细胞)的特点。将二者结合产生的基于凝集素的流式细胞技术可用于检测血小板及细胞表面的糖基化水平，相较于其他糖链分析技术，该方法样本前处理分析过程简单，可避免人为操作造成的结果差异[24]。

4 展望

虽然糖链结构通过质谱方法可获得较为全面的信息，但对于糖蛋白糖基化修饰差异所致细胞或机体功能的改变目前并没有较为统一的研究方法。血小板离体后受外界环境影响易活化，离体修饰后难以用体内试验来研究糖基化修饰差异对血小板功能的影响，而这些因素均对糖基化修饰差异与血小板功能影响的研究造成了很大的困难。目前，对已明确的血小板糖蛋白糖基化修饰的功能及其对机体的影响并没有更详细的研究。了解血小板糖基化，有利于对血小板异常糖基化导致血小板功能的改变以及与疾病发生发展关系的进一步研究，可为疾病的治疗及诊断提供参考价值。

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10.13602/j.cnki.jcls.2017.12.18

李丽萍，1992年生，女，硕士研究生，研究方向：临床检验诊断学。

屈晨雪，博士，副主任医师，E-mail：qucx2012@hotmail.com。

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王海燕)