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（1. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨 150069；2. 河南省动物疫病预防控制中心， 河南郑州 450008；3. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

黑龙江省一起牛曼氏杆菌病疫情的暴发调查

刘春国1，郭东春1，刘大飞1，曹伟伟2，王靖飞1，韦欣捷3，曲连东1

（1. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨 150069；2. 河南省动物疫病预防控制中心， 河南郑州 450008；3. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

2015年11月14日至12月14日，黑龙江省某县多个村从外县购入的牛发生不明原因的急性死亡。发病牛主要表现呼吸道症状，从发病到死亡的时间为几小时到数天不等，病死牛剖检可见严重肺炎病变。为揭示疫病暴发的主要病因，提供防控建议，结合现场流行病学调查和实验室诊断，对该次疫情开展了调查。调查结果显示：此次疫情波及6个村，发病牛多为1岁左右；时值气候寒冷；疫情发生前1周左右，有牛调运史。实验室诊断结果显示，采集的样本中均含有未分类的曼氏杆菌，其对氨苄西林和环丙沙星耐药，而对头孢曲松敏感。最终确认本次疫情是由牛群调运、寒冷气候和年龄等风险因素相互作用，诱发曼氏杆菌的内源性感染所致。

牛；曼氏杆菌；流行病学；暴发调查；耐药性

2015年11—12月，黑龙江省某县多个村发生1岁左右牛病死事件。病牛主要表现呼吸道症状，从发病到死亡时间为几小时到数天不等，病死牛剖检可见严重肺炎病变。为查明发病原因，提出防控措施，12月19日，在当地乡镇兽医的陪同下，对此次疫情开展了回顾性调查，以期为养殖场户预防类似事件的再次发生提供借鉴。

1 材料与方法

1.1伦理审查

本次调查研究经中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物伦理审查委员会许可，并征得养殖场户的同意。

1.2病例定义

2015年11月14日至12月14日期间，在黑龙江省某县下辖村养殖的育肥牛出现咳嗽、流涕、呼吸困难和死亡等症状之一的，即判定为疑似病例。PCR检测和基因分析结果阳性的，即确诊为阳性病例。

1.3调查方法

2015年12月19日，在当地兽医陪同下，到疫情所在地某个村（以下简称A村）与最先发病并且疫情最为严重的养殖场户（以下简称养殖场户A）进行现场访谈，了解当地的养殖基本情况和疫病发生的具体经过等信息，并进行现场流行病学调查和实验室检测。

1.4样本采集

从2个养殖场户的发病牛中各采集2份鼻腔拭子。其中，一部分置于30%甘油中，4 ℃保存，待做细菌和支原体鉴定；另一部分置于50%甘油中，-20 ℃保存，待做牛呼吸道疾病相关病毒的鉴定。

1.5实验室诊断

将采集的4份病牛鼻腔拭子液，接种于血液琼脂平板上进行细菌学培养鉴定；将纯培养的细菌，用梅里埃VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定及药敏分析系统进行生化和药敏分析。提取纯培养细菌的DNA，用细菌16S rRNA通用引物Bac16sF：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'和Bac16sR：5'-GTGTGACGGGCGGTGTGTAC-3'进行PCR鉴定；用牛支原体和牛呼吸道疾病相关病原（包括牛副流感病毒3型、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛呼吸道合胞体病毒）的特异性检测引物进行PCR检测。

2 结果

2.1现场流行病学调查结果

2.1.1养殖管理概况。A村地理位置处于东经126°03'，北纬46°75'，距离主干公路202国道3 km。A村共有30户人家，其中有11户饲养育肥牛，每户养殖数量从十几头到四十几头不等，共计饲养300余头。每户的饲养模式基本相同，即每年10月至11月份从外县购入1岁左右的牛，育肥至下年的9月份全部出栏。养殖场户A从2004年开始从事育肥牛养殖，养殖品种主要为西门塔尔牛，少数为夏洛莱牛。养殖场占地面积约300 m2，养殖数量为41头，1岁左右。养殖场内有家犬、老鼠和麻雀出入，偶尔有外来人员来访，畜主基本不到其他养殖场户走动。所用的饲料均为正规饲料公司生产，早晚各饲喂一次。饮用水为自家井水，未经消毒处理，直接饮用。未聘用饲养员，畜主自己饲养。周边没有大型活牛交易市场，仅在5 km外有一小型私人屠宰场。之前，该村每年偶尔会出现两三头表现严重呼吸道症状并死亡的牛。牛舍内外没有生物安全防护设施，粪便每天清理，堆放在门前道路两边。没有养殖档案，也没有无害化处理设施。

2.1.2疫情描述。2015年11月5日至9日，A村养殖场户A从60 km外的B县不同养殖场户分3批购入41头1岁左右的牛，直接混群饲养。最后一批牛引进后第3天进行了口蹄疫疫苗免疫，除此之外，未进行其他疫苗的免疫接种。牛引进后数日开始表现呼吸道症状，初期呈现急性死亡，随后病期延长。牛发病后，养殖场户自行采取抗生素治疗，但效果不佳，发病后第5天，畜主寻求当地兽医诊治，效果亦不理想。随后，自行用多种抗病毒和抗细菌药物治疗。死亡或濒死的牛只，由私人屠宰场上门拉走，无任何消毒防范措施。12月14日之后，未再出现牛死亡情况。此次疫情中，该养殖场户共有23头牛发病，其中10头死亡，袭击率为56.1%，病死率为43.5%。

2.1.3时间分布。2015年11月14日牛群中出现首个病例，第2天死亡；至第5天，发病数量增加到4头；随后每天发病数在0～3头之间。11月29日牛群停止发病。12月14日，无新死亡病例。流行曲线见图1。

2.1.4空间分布。根据养殖场户和乡镇兽医描述，此次疫情共波及6个村（分别为A、B、C、D、E、F村）。其中A村最先发病，并且疫情最为严重。A村的11个养殖场户均发生疫情，共死亡40余头牛。其他5个村疫情情况为：B村有5个养殖场户的小牛发病；C村3头小牛发病死亡；D村有2个养殖场户的成年牛和小牛发病，其中死亡小牛3头 ；E村和F村各有1个养殖场户的小牛发病。发病牛均具有相似的临床症状。这些养殖场户近期均有从外地引进牛的经历。养殖场户A的牛饲养于2个牛棚中（图2）。A棚舍中的1头牛首先发病，随后发病的牛在棚舍内随机分布。

图1 养殖场户A的病例时间分布

图2 养殖场户A的病例空间分布

2.1.5群间分布。此次疫情中，发病死亡的牛大多为1岁左右，成年牛较少，未见死亡。

2.1.6临床及剖检变化。病牛主要表现为高热、咳嗽、喷嚏、流黏脓性鼻涕。根据养殖场户和乡镇兽医描述，病牛主要表现为严重肺炎病变，呈现纤维素性肺炎和浆液纤维素性胸膜炎。肺组织肉样变，切面呈大理石样，表现严重的肺充血、出血、肿胀、坏死、萎缩，颜色呈暗红或黑红色；淋巴结肿大，呈紫色。

2.2实验室诊断结果

2.2.1细菌分离培养及生化鉴定。将采集的拭子液接种于血液琼脂平板，37 ℃培养24小时后，可见有灰白色、圆形、光滑、湿润的，具有溶血特征的露珠样菌落呈优势生长。革兰氏染色镜检，可见革兰氏阴性两端钝圆短小杆菌。用梅里埃VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定及药敏分析系进行生化和药敏鉴定，结果显示该菌属于曼氏杆菌属；该菌对氨苄西林和环丙沙星耐药，而对头孢曲松敏感。

2.2.2鉴别诊断。采用支原体以及牛呼吸道相关病毒性疾病的病原特异性引物进行PCR检测，结果均为阴性。

2.2.3分子鉴定。提取纯培养细菌的DNA，用16S rRNA引物进行PCR鉴定。测序结果用Lasergene7.0中的Seqman拼接后，用Mega5软件进行遗传发育树构建，结果发现4个分离菌株（QG1-4）与未分类的曼氏杆菌处于同一进化分支（图3）。

图3 基于16S rRNA部分序列的进化树

3 讨论

曼氏杆菌属包括溶血性曼氏杆菌（Mannkimia haemolytic）[1-2]、肉芽肿曼氏杆菌（Mannkimia granulomatis）[3-4]、反刍兽曼氏杆菌（Mannkimia ruminalis）、多源曼氏杆菌（Mannkimia varigena）[5]和葡萄糖苷曼氏杆菌（Mannkimia glucosida）[6]，以及一部分未分类的曼氏杆菌[7-8]。研究表明，牛曼氏杆菌病主要病原是溶血性曼氏杆菌，但肉芽肿曼氏杆菌、反刍兽曼氏杆菌和多源曼氏杆菌也可导致牛呼吸道疾病。溶血性曼氏杆菌是健康牛上呼吸道中的常在菌，与宿主呈共栖状态[9]，在应激因素作用下，可引起内源性感染。本病多呈地方流行或散发，发病动物以幼龄为主，病死率较高。本病的发生一般无明显的季节性，但在冷热交替、气候剧变、闷热、潮湿、多雨的时期发生较多。体温失调、抵抗力降低也是本病的主要诱因之一。研究表明，溶血性曼氏杆菌作为“运输热肺炎”的病原，经常从船运和转移展览牛、新购进育肥牛中分离出来[10]。受到应激的牛一般在1～2周后出现典型的肺炎症状，潜伏期最短为1～3天。

实验室诊断结果表明：此次疫情是由未分类曼氏杆菌引起的内源性感染。流行病学调查发现，此次疫情中，由于病牛调运，导致牛产生应激反应。另外，由于北方11月份天气寒冷，所引进的都是1岁左右的小牛，而且牛只引进后未观察隔离即进行口蹄疫疫苗免疫接种。这些因素增加了应激反应的程度，诸多因素共同作用，导致牛抵抗力下降，内源性曼氏杆菌大量增殖，从而诱发了呼吸道疾病的暴发。

此次调查比较滞后，而且由于时间原因，仅选择疫情最严重村、最先发生疫情且最为严重的养殖场户进行调查，而其他养殖场户和其他村的牛发病信息，主要来源于被调查养殖场户和乡镇兽医的回忆性描述。因此，未能获得全部的详实数据，存在一定的信息偏倚，也未能对疾病进行有效地追踪和溯源。但选择的被调查对象具有较好的代表性，在整体上也能还原疫情的经过，流行病学调查和实验室诊断结果能有效支持所获得的结论。

4 结论及建议

根据临床症状、病理变化和实验室检测结果，并结合流行病学调查数据，可以判断此次疫情是由于冬季调运等应激因素导致的1岁左右牛的内源性曼氏杆菌感染。根据该地区的养殖特点，除了加强常规的饲养管理和卫生防疫以外，对养殖场户提出如下几点具体建议：（1）在引进动物时应该选择良好的天气，装车和卸车以及运输途中尽量减少动物的应激；（2）加强对引进动物的隔离观察，1周后无临床症状方可混群；（3）牛只引进后2周方可进行疫苗接种；（4）动物一旦发病，马上隔离，及时寻求专家帮助，尽早确诊和对症治疗；（5）对病死牛进行无害化处理，避免疫情扩散。

[1]RAINBOLT S，PILLAI D K，LUBBERS B V，et al. Comparison of Mannheimia haemolytica isolates from an outbreak of bovine respiratory disease [J]. Vet Microbiol，2016，182：82-86.

[2]LU S S，SUN Y W，DENG G D，et al. Isolation and identi fi cation of bovine Mannkimia haemolytic [J]. Chinese J Vet Med，2011，52（1）：54-57.

[3]KAWASHIMA Y，TAKAHASHI H，SHIMOO M，et al. Eosinophilic granuloma with Splendore-Hoeppli material caused by Mannheimia granulomatis in a calf [J]. J Vet Med Sci，2016，78（6）：1075-1708.

[4]BLUM S，FREED M，ZUKIN N，et al. Bovine subclinical mastitis caused by Mannheimia granulomatis [J]. J Vet Diagn Invest，2010，22（6）：995-997.

[5]HARHAY G P，MURRAY R W，LUBBERS B，et al. Complete Closed Genome Sequences of Four Mannheimia varigena Isolates from Cattle with Shipping Fever [J]. Genome Announc，2014，2（1）：e00088-14.

[6]OMALEKI L，BROWNING G F，ALLEN J L，et al. Molecular epidemiology of Mannheimia haemolytica and Mannheimia glucosida associated with ovine mastitis [J]. J Vet Diagn Invest，2012，24（4）：730-734.

[7]LARSEN J，PEDERSEN A G，CHRISTENSEN H，et al. Evidence for vertical inheritance and loss of the leukotoxin operon in genus Mannheimia [J]. J Mol Evol，2007，64（4）：423-437.

[8]BRITTON A P，ZABEK E N. Bronchopneumonia in two dairy calves associated with Mannheimia species cluster V infection [J]. J Vet Diagn Invest，2012，24（6）：1043-1046.

[9]OMALEKI L，BROWNING G F，ALLEN J L，et al. The upper respiratory tract is a natural reservoir of haemolytic Mannheimia species associated with ovine mastitis [J]. Vet Microbiol，2015，181（3/4）：308-312.

[10]TIMSIT E，CHRISTENSEN H，BAREILLE N，et al. Transmission dynamics of Mannheimia haemolytica in newlyreceived beef bulls at fattening operations [J]. Vet Microbiol，2013，161（3/4）：295-304.

（责任编辑：朱迪国）

An Outbreak Investigation on Bovine Mannheimiosis in Heilongjiang Province

Liu Chunguo1，Guo Dongchun1，Liu Dafei1，Cao Weiwei2，Wang Jingfei1，Wei Xinjie3，Qu Liandong1
（1. State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin，Heilongjiang 150069；2. Henan Animal Diseases Control & Prevention Center，Zhengzhou，Henan 450008；3. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

During November 14th to December 14th，2015，an acute death of unknown origin occurred in cattle purchased from another county in several villages of Heilongjiang province. These diseased cattle mainly showed respiratory symptoms and the time periods of morbidity to death were various（ranging from several hours to a couple of days）. By autopsy diagnosis，severe pneumonia was found. In order to fi nd out the cause and provide suggestions for its prevention and control，an investigation was conducted by fi eld epidemiological survey in combination with laboratory diagnosis. Investigation results showed this outbreak covered 6 villages，most diseased cattle were around the age of 1. In addition，the weather was cold during the epidemic period. And about a week before outbreak，the cattle had been allocated and transported. Based on the results of laboratory diagnosis，it was found that unclassi fi ed Mannkimia existed in all the collected samples，these strains were resistant to both Ampicillin and Cipro fl oxacin，but sensitive to Ceftriaxone. Eventually，the cause of death was con fi rmed as endogenous infection of Mannkimia，which was induced by interaction of major risk factors，including allocation and transportation of the cattle，their ages and the cold weather，etc.

cattle；Mannkimia；epidemiology；outbreak investigation；drug resistance

S851.31+3

：A

：1005-944X（2017）02-0001-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.02.001

联合国粮农组织-中国兽医现场流行病学培训项目；科技部科技基础性工作专项（2012FY111000）

韦欣捷、曲连东