张军耀，夏敬云

（1.新昌县大众化工有限公司，浙江绍兴 312500；2.浙江来益生物技术有限公司，浙江嵊州 312400）

D-氨基酸氧化酶的分离纯化及固定化研究

张军耀1，夏敬云2

（1.新昌县大众化工有限公司，浙江绍兴 312500；2.浙江来益生物技术有限公司，浙江嵊州 312400）

在工业生产的原料当中，D-氨基酸氧化酶属于一种具有重要的工业价值的原料，可以良好构建出大肠杆菌中经过乳糖诱导发酵的表达式，从而对其中的菌体进行提取粗酶液，在进行固化提纯的过程当中，需要保证其中的活性物质的活性没有明显的损失，提升其底物部分的转化率，因此就需要对氨基酸氧化酶的分离提纯技术进行研究。首先对 D-氨基酸氧化酶进行了概述，其次对其提纯固化的方式进行了研究。

D-氨基酸氧化酶；分离纯化 ；固定化

随着现代工业的不断发展，很多新型的原料被应用在了工业生产当中，在提高了工业生产效率的同时，也对于原料资源的利用程度进行了不断的提高。在这个过程当中，氨基酸氧化酶便是一种相当重要的原材料，可以利用其催化反应进行形成相对应的酮酸和氧，并且将氧化氢等物质进行释放。在对物质进行提纯的过程当中需要进行不断的深入研究，从而保证其提纯过程当中纯净程度，从而为工业生产提供更高纯净度的原材料。

1 D-氨基酸氧化酶概述

D-氨基酸氧化酶，属于一种以黄素腺嗓吟二核昔酸为辅基的典型黄素蛋白酶类，在实际的生产应用当中可以对其进行催化，其中产生的氧化脱氧反应可以生成相对应的酮酸和氧，在其中会受到分子氧气的还原影响，进行氧化氢的释放。在这个过程当中，由于酶对于其催化反应当中底物的高度在选择方面是具有相当大的光谱性的，因此可以利用此种特点来对其进行定量分析，在分析当中，需要充分的实现两步酶法进行生产。在 D-氨基酸氧化酶的实际应用当中，在工业生产当中可以作为主要的工业用酶进行实际的应用，并且也受到了工业生产者的广泛关注，因此需要对氨基酸氧化酶进行基础性的研究以及生物催化剂的研究开发。

2 提纯固化的方式的实验研究

2.1 实验材料以及实验方法

在进行实验研究的过程当中，首先需要对其材料进行确定，在本实验当中，需要以自制的氨基酸氧化酶进行为主要的研究对象，实现对其大肠杆菌的实验研究。

在进行实验的过程当中，首先需要对其活力进行不断的测定，需要以D-甲硫氨酸为底物，来进行检测DAAO的活力，并且在检测的过程当中还要根据酶和 D-甲硫氨酸底物反应生成相应的酮酸，但是而在碱性条件下酮酸与2，4-二硝基苯肼反应，并且有可溶性棕色生成物出现，因此还要在550nm 处进行定量测定。酶的活力可以定义为在 pH 值为8.5的情况下，并且其周围的环境温度保持在37℃的情况下可进行每分钟产生1μg 的酮酸所需要的酶的含量为一个活力单位。

在对氨基酸氧化酶的分离纯化的实验当中，需要对其中存在的菌体按照3∶1的比例加入磷酸缓冲液当中，在对其进行搅拌均匀之后，就可以实现在冰浴当中进行超声，最终使得菌体当中得到充分的破碎。在进行实验的时候，需要将氨基酸氧化酶无细胞提取液按照规定的比例加入到载体当中，在保证和载体进行充分融合之后，就可以充分地对其实验洗白，最终得到纯酶液，来进行固定化的研究。

最后在对DAAO进行固定化的实验当中，可以利用纯酶液进行实验检测，用环氧活化的聚丙烯酸载体来进行固定化，并且按照载体和纯酶的科学的比例下利用磷酸来进行缓冲液的洗涤，在4℃的温度下得到保存备用之后，就可以取得固定化的酶，之后就可以对其中的蛋白吸附率以及活力回收率进行计算，最终对其固定效果进行考察。

2.2 实验结果与结论

经过上述的实验方式，可以得出超声破壁的最适当的时间，在经过不同时间的超声破壁的实验下，可以发现其超声在16min 的工作时间之内，其中酶的活力是处于最高的状态当。如果时间过长的话，酶的活力反而会下降，在这个过程当中超声的时间在过长的情况下，会在很大程度上引起酶液的温度的升高，而对酶的活力造成不利的影响，最终影响其蛋白的增多。

在载体当中投入不同比例的酶的时候，在对载体自身的吸附率也会产生一定程度的影响，一般情况下，载体自身吸附量会随着粗酶液当中蛋白量的增加而得到不断的增加现象的，如果载体达到一定程度的饱和状态的时候，吸附量就会停止增加，如果酶自身和载体的比例在增加的情况下，酶活的概率和纯化的倍数也会不断的增加，但是在得到一定程度的参数值之后，就会出现下降的现象，其中的原因主要是由于载体当中吸附量如果达到了一定的数值之后，酶的吸附力就需要两者之间产后更大的吸附能力，如果产生了接近或者达到载体的饱和程度的情况下，酶自身当中的吸附能力就很难增加，因此就会造成残留的酶酶不断增加的现象。

在本文中进行的实验当中，所应用到的粗酶和载体之间的比例为600U ∶ 1g，其中的超声波破碎离心得50mL 的粗酶液，在经过一定程度的分离纯化之后就会得到相对应的10mL的纯酶液，其中纯化倍数可以达到自身的 9.91 倍之多，并且酶活的率达到了38.35%。其中在 DAAO 分离纯化流程当中，ell-freeextract的数值分别在 50、1 504.8、262.78、5.73、1.0 以及 100 的情况下，相对应的 PI-30-IDA-CoAffinitypurification 的数值分别为 10、577.15、10.717、56.742、9.91 以及 38.53。

最后，在对固定化酶和游离性质的酶进行比较的时候，经过环氧载体的固定之后，其中的固定化的酶活力保持在9.996，并且其中的活力回收达到了42.44%，其中的蛋白吸附率达到了98%。对其最适合反应的温度进行了确定，经过实验可以说明了游离情况下的酶最适反应体系温度为35℃，固定化酶的最适反应温度都有所提高到40℃。

在固定化酶的pH稳定性的研究当中，在本文当中进行了不同程度的研究，并且还要放置在2h以上，然后还需要其中的残余的酶活力进行测定，经过检测证明，游离状态下的酶的 pH 在 8.5～9.0 的稳定性是相对较好的，但是固定化的酶 pH稳定性是相对较宽的。

3 结束语

综上所述，在进行氨基酸氧化酶的提纯过程当中，和金属离子有着相当高的亲和性，因此在进行提纯的时候可以利用其自制的金属离子来实现对其的分离纯化，最终保证酶的活性综合可以在35% 以上。在进行提纯固化的过程当中，需要利用一系列的载体来进行固定化，保证其热稳定性以及pH的稳定性可以在一定程度上得到不断的提升，此种现象对于固定化酶的实际应用方面是具有相当有利的条件，在对酶进行固定化之后，酶当中的实际载体会实现多点结合地现象，最终保证酶的结构可以更加牢固和稳定，最大程度的提升其稳定性，为工业化生产应用提供了相当广阔的前景基础。

[1] 王筱兰，孙兵兵，杨志平 ，等.D- 氨基酸氧化酶的 分离纯化及固定化研究[J].南昌大学学报（工科版），2008，30（2）：112-115.

[2] 孙兵兵.D- 氨基酸氧化酶基因的诱导表达及酶工程的研究[D].南昌：南昌大学，2007.

[3] 邓森文.D- 氨基酸氧化酶和青霉素G酰化酶的分子改造与应用研究[D].上海：华东理工大学，2015.

[4] 李玲.L- 谷氨酸氧化酶发酵条件及分离纯化的研究[D].济南：山东轻工业学院，2012.

Study on Isolation，Purification and Immobilization of D-Amino Acid Oxidase

Zhang Jun-yao，Xia Jing-yun

In the raw materials of industrial production，D-amino acid oxidase belongs to a kind of raw material which has important industrial value.It can construct the expression of lactose-induced fermentation in Escherichia coli，so as to extract the bacteria In the process of curing and purification，it is necessary to ensure that there is no significant loss of the activity of the active substance，and the conversion rate of the substrate is improved.Therefore，it is necessary to study the separation and purification technology of amino acid oxidase The In this paper，the D-amino acid oxidase was first reviewed，and the practical application of the method was studied.

D-amino acid oxidase；isolation and purification；immobilization

Q814

B

1003-6490（2017）06-0175-02

2017-05-11

张军耀（1966—），男，浙江绍兴人，工程师，主要研究方向为医药化工。