李龙滕 李彦林 王坤 闫祥甲 肖渝 贾笛 王国梁

昆明医科大学第一附属医院运动医学科（云南 昆明 650032）

TN14003体外阻断SDF-1/CXCR4信号通路对骨关节炎患者软骨组织分泌基质金属蛋白酶3、9、13水平的影响

李龙滕 李彦林 王坤 闫祥甲 肖渝 贾笛 王国梁

昆明医科大学第一附属医院运动医学科（云南 昆明 650032）

目的：探讨TN14003体外阻断基质细胞衍生因子-1/趋化因子受体-4（SDF-1/CXCR4）信号通路对骨关节炎（osteoarthritis，OA）患者软骨组织分泌基质金属蛋白酶3、9、13（MMP-3、MMP-9、MMP-13）水平的影响，明确TN14003的作用机理和阻断效果。方法：对6例OA患者行膝关节置换术中采集透明软骨，切成3×3×3 mm3大小的软骨组织块（共140块），平均分为A、B、C、D四组进行体外培养，A、B、C三组分别加入TN14003、T140、AMD3100（使其在培养液中的最终浓度为1000 nmol/L），D组为空白对照组，四组培养液中均加入相同剂量SDF-1使其最终浓度为100 ng/ml，分别培养2、4、6、8、10天后取各组组织块培养液，采用ELISA检测培养液中MMP-3、MMP-9、MMP-13的含量。结果：相同时间点，MMP-3、MMP-9、MMP-13的分泌量A组低于B组（P＜0.05），B组低于C组（P＜0.05），C组低于D组（P＜0.05）；同一组内不同时间点，MMP-3、MMP-13的分泌量随时间而呈现总体降低趋势（P＜0.05），MMP-9的分泌量随时间而呈现升高趋势（P＜0.05）。结论：TN14003、T140、AMD3100均可阻断SDF-1/CXCR4信号通路，减低MMP-3、MMP-9、MMP-13的分泌，尤其以TN14003阻断效果最为确切。

SDF-1/CXCR4；基质金属蛋白酶；骨关节炎；TN14003

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是多种原因导致的慢性滑膜关节疾病，以关节疼痛和活动受限为主要临床表现；OA的发生、发展常伴随着软骨细胞的凋亡和软骨组织的破坏。我们前期研究发现[1-3]：基质细胞衍生因子-1/趋化因子受体-4（stromal cell derived factor-1/CXC chemokine receptor 4，SDF-1/CXCR4）信号通路的激活在OA发生、发展过程中起到重要作用，该信号通路的特异阻滞剂（AMD3100和T140）可抑制基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）3，9，13的表达，延缓OA关节软骨的退变，但由于AMD3100的毒副作用和T140的血清不稳定性，限制了临床的应用，而TN14003作为T140的衍生物，具有比T140更好的血清稳定性及更小的细胞毒性，其临床应用前景广泛[4]。本实验探索TN14003对骨关节炎软骨组织分泌MMP-3、MMP-9、MMP-13水平的影响，为临床寻找治疗骨关节炎的分子靶向药物提供理论依据。

1 材料与方法

本实验在昆明医科大学工程研究中心完成。

1.1 主要试剂、仪器

SDF-1（peprotech公司，美国），T140、TN4003（中科亚光公司，中国），AMD3100（peprotech公司，美国），MMP-3试剂盒（Rebiotech），MMP-9、MMP-13试剂盒（R&D），高速冷冻离心机（eppeadorf 5415R），多功能酶标仪（BIOTEK Synergy2），恒温箱（THZ-032 SHAKER）。

1.2 培养液的制备

先以高糖DMEM培养液445 ml、胎牛血清50 ml、青霉素+链霉素混合溶液5 ml配制成10%的胎牛血清，调整pH值至7.3～7.4，0.22 μm微孔过滤器过滤除菌并分装在50 ml无菌管中，4℃冰箱密封保存。

1.3 药物配制

TN14003、T140、AMD3100原装1 mg瓶装固体粉末，SDF-1原装10 μg瓶装固体粉末从-20℃冰箱中取出，室温下复温，加入适量经高温灭菌的三蒸水充分溶解使TN1400、T140、AMD3100溶液浓度分别为0.25 mg/ml、0.25 mg/ml、0.1 mg/ml，SDF-1溶液浓度为10 μg/ml，然后按需要量分装，-20℃冰箱中保存。

1.4 标本获取及培养

组织标本均来自于昆明医科大学第一附属医院，在征得患者及家属同意后，分批次取6例确诊为骨关节炎（排外其他关节疾病）而行膝关节置换的股骨髁软骨组织块，在手术室无菌条件下将软骨组织块切成3× 3×3 mm3大小的软骨组织块（共140块），放在含有1%青霉素+链霉素混合溶液的DMEM液中，迅速转运至实验室，在超净工作台上经PBS液充分洗涤去除血液及杂质后将软骨组织块放在含10%胎牛血清和1%青霉素+链霉素混合溶液的DMEM液（3 ml）的6孔板里，37℃、5%的CO2培养箱里培养3天，然后随机将软骨组织块（共140块）分为A、B、C、D四组，每组35块，放在24孔板里，每孔7块软骨组织块，每孔加入10%胎牛血清和1%青霉素+链霉素混合溶液的DMEM液（1ml），四组均加入10 μl浓度为10 μg/ml SDF-1溶液，A组加入8.1 μl浓度为0.25 mg/ml的TN14003溶液，B组加入8.1 μl浓度为0.25 mg/ml的T140溶液，C组加入5 μl浓度为0.1 mg/ml的AMD3100溶液，使A、B、C三组培养液中TN14003、T140、AMD3100的最终浓度为1000 nmol/L，37℃、5%的CO2培养箱里培养（每2天换液一次），各组于培养第2、4、6、8、10天分别采集各组组织块的培养液放置在-80℃的超低温冰箱里，待全部培养液收集完毕后统一进行ELISA检测。

1.5 ELISA检测培养液中MMP-3、MMP-9、MMP-13的含量

待收集全所有各组软骨组织块培养液（n=6）后，从超低温冰箱取出，室温下解冻，采用双抗体夹心ELISA检测各组培养液中的MMP-3、MMP-9、MMP-13的含量。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0进行统计学分析，数据采用均数±标准差表示，组间对比采用重复资料的方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

相同时间点各组MMP-3、MMP-9、MMP-13的含量A组低于B组（P＜0.05），B组低于C组（P＜0.05），C组低于D组（P＜0.05），差异具有统计学意义，且MMP-3的含量较高。同一组内不同时间点，MMP-3的含量随时间延长而呈现降低趋势，且差异具有统计学意义（P＜0.05）；MMP-9的含量随时间而呈现逐渐升高趋势，且差异具有统计学意义（P＜0.05）；MMP-13的含量在培养的前4天呈现逐渐升高，之后又缓慢降低的趋势，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组MMP-3、MMP-9、MMP-13含量（ng/ml）（各组均n=6）

3 讨论

3.1 MMPs在骨关节炎发病中的作用

骨关节炎关节软骨的退变主要通过两条途径而发挥作用[5，6]：一是软骨细胞自身的退变，OA患者软骨组织中可发现较多凋亡的软骨细胞，且软骨细胞的凋亡与软骨的退变密切相连。二是通过侵蚀性炎性细胞、血管翳、炎性关节液中的各种酶等因素导致的细胞外基质的破坏，尤其以MMPs对软骨的破坏最为重要。MMPs为一种Zn+2依赖的蛋白酶超家族，可降解细胞外除多糖外的所有基质[7]。且有研究证实[6]：软骨细胞外基质在细胞存活中起到关键作用，在OA病理进程中MMPs可直接和间接促进软骨细胞的凋亡。而软骨细胞的退变必然使得细胞外基质合成减少，加速关节软骨的退变。故本研究采用对OA关节软骨退变发挥关键作用的MMP-3、MMP-9、MMP-13进行研究，进一步明确MMPs在OA关节软骨退变中的作用。本实验结果发现：OA关节软骨体外培养液中均有MMP-3、MMP-9、MMP-13分泌，且以MMP-3的分泌量最高，故我们认为MMP-3可能是导致OA关节软骨退变的主要细胞因子之一。

3.2 SDF-1/CXCR4信号通路在骨关节炎发病中的作用

目前研究发现OA患者血浆和关节液中SDF-1的含量较正常人明显增高，且其含量与骨关节炎的严重程度成正相关[8]；SDF-1受体有CXCR-4和CXCR-7，人关节软骨和成纤维样滑膜细胞中均有大量的CXCR4和CXCR7的表达[9，10]。在基因水平敲减CXCR4基因后，CXCR4的mRNA的转录和表达水平受到抑制，MMP-13的表达水平降低，同时抗CXCR4抗体可以减少培养液中MMP-13的含量[11]。SDF-1α与其受体结合后可导致人软骨细胞AP-1复合物（c-Fos和c-Jun）及其mRNA表达水平上调和AP-1复合物的激活，最终使得MMP-13表达增加，从而导致Ⅱ型胶原蛋白的降解，促使关节软骨的破坏；而通过抑制AP-1复合物与MMP-13基因启动子的AP-1结合位点（-50～-44bp）结合，从而降低SDF-1α导致的关节软骨的破坏[6]。我们课题组前期研究发现SDF-1/CXCR4信号通路的活化可促进MMP-3、MMP-9、MMP-13的合成和分泌，通过该信号通路抑制剂（AMD3100、T140）可以抑制MMP-3、MMP-9、MMP-13的合成和分泌，延缓骨关节炎的病理进程。可见，探索阻断SDF-1/CXCR4信号通路的靶向药物有利于找到治疗OA的新途径。

3.3 TN14003阻断SDF-1/CXCR4信号通路对OA软骨组织分泌MMP-3、MMP-9、MMP-13的作用

AMD3100作为SDF-1/CXCR4信号通路的部分阻滞剂，主要通过与CXCR4的第二胞外环状区结合，特异性阻断CXCR4与其配体结合，其阻断效果不完全。T140是一种由14氨基酸残基组成的小分子肽，为CXCR4的反向抑制剂，相对于AMD3100，T140对SDF-1/CXCR4信号通路具有更强的阻断效应，但由于T140在血清中其羧基端的Arg容易被降解，血清稳定性差，因此本实验采用T140衍生物TN14003，与T140相比，TN14003具有更好的血清稳定性及低细胞毒性[12]。本实验结果显示：在OA关节软骨组织体外实验中，TN14003在阻断SDF-1/CXCR4信号通路导致的OA软骨组织分泌MMP-3、MMP-9、MMP-13释放方面有着明显的优势，其阻断效应比T140和AMD3100更强。MMP-3在OA关节软骨组织体外培养液中呈现高分泌状态，通过抑制SDF-1/CXCR4信号通路可以降低MMP-3的分泌，尤其以TN14003的抑制作用最强；且随着体外培养时间的延长，A、B、C、D四组中MMP-3的分泌量呈现逐渐降低的趋势，我们推测其原因为：其一，体外软骨细胞培养过程中，软骨细胞随着时间延长会出现软骨细胞去分化[13]，其合成与分泌功能将会下降；其二，我们所选择的均是老年OA中、晚期行全膝关节置换术的样本，其关节软骨细胞的功能明显降低，各种蛋白的合成和分泌功能均下调。MMP-9在OA关节软骨体外培养液中分泌量相当少，且随着培养时间的延长其分泌量呈现逐渐升高趋势，其原因我们认为：SDF-1/CXCR4信号通路可能不是MMP-9合成和分泌的最主要的信号通路，MMP-9的合成和分泌另有其他信号通路或者细胞因子的参与。MMP-13在OA关节软骨体外培养液中呈现一定量的分泌，通过抑制SDF-1/CXCR4信号通路可以降低MMP-13的表达，且随着体外培养时间的延长，A、B、C、D四组中MMP-13的表达量在体外培养的前4天内有轻微上升的趋势，之后呈现出缓慢降低的趋势，其原因可能为我们所选取样本均是来源于中、晚期OA行全膝关节置换术者，而MMP-13主要在OA的早、中期表达，且随着时间的延长，MMP-13的表达量逐渐降低[14]。许多学者认为MMPs的各种亚型在OA病理进程的各个时期呈现动态变化状态，MMP-3主要在OA的早期和晚期增高明显，MMP-9主要在OA的早期增高明显，MMP-13在主要在OA的早、中期表达[14]。MMPs的各个亚型在OA不同时期表达的规律也很好地诠释了本实验中MMPs表达随时间变化呈现不同趋势的结果。

综上所述，SDF-1/CXCR4信号通路的活化可促进OA软骨细胞MMP-3、MMP-9、MMP-13的分泌，通过该信号通路抑制剂（TN14003、T140、AMD3100）可以抑制MMP-3、MMP-9、MMP-13的分泌，且TN14003在阻断该信号通路降低MMP-3、MMP-9、MMP-13分泌方面具有更好的阻断效果。

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The Influence of Blocking SDF-1/CXCR4 Signaling Pathway with TN14003 In Vitro on the Levels of Matrix Metalloproteinases 3，9 and 13 in Osteoarthritis Cartilages

Li Longteng，Li Yanlin，Wang Kun，Yan Xiangjia，Xiao Yu，Jia Di，Wang Guoliang
The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650032，China Corresponding Author：Li Yanlin，Email：852387873@qq.com

ObjectiveTo explore the influence of blocking the stromal cells derived factor-1/CXC chemokine receptor 4（SDF-1/CXCR4）signaling pathway using TN14003 on matrix metalloproteinases（MMP）3，9 and 13 levels secreted from osteoarthritis（OA）cartilages，so as to clarify the mechanism and effect of TN14003.MethodsArticular cartilage specimens were obtained from 6 OA patients during the total knee arthroplasty（n=6），cut into 140 explants of 3×3×3 mm3and randomly divided into group A，B，C and D，each of 35.Explants in group A，B and C were incubated in the nutrient solution containing SDF-1（100 ng/ml）and TN14003，T140 and AMD3100（1000 nmol/L）respectively，while explants in group D were incubated in the nutrient solution with SDF-1（100 ng/ml）only.The culture medium was collected on the end of the 2nd，4th，6th，8th and 10th day to measure the levels of MMP-3，MMP-9 and MMP-13 using ELISA.ResultsAt the same time points，the average levels of MMP-3，MMP-9 and MMP-13 of group A were significantly lower than group B，those of group B significantly lower than group C，which was significantly lower than group D.In the same group，the average levels of MMP-3 and MMP-13 decreased（P＜0.05）gradually and that of MMP-9 increased gradually as（P＜0.05）the intervention went on.ConclusionsTN14003，T140 and AMD3100 all can decrease the secretion of MMP-3，MMP-9 and MMP-13 through blocking the SDF-1/CXCR4 signaling pathway，with TN14003 showing the best effect.

SDF-1/CXCR4，MMPs，Osteoarthritis，TN14003

2016.11.03

国家自然科学基金资助项目（编号81460340）；云南省创新团队项目（编号2014HC018）；云南省医疗卫生单位内设研究机构项目（编号2014NS161）

李彦林，Email：852387873@qq.com