林丽聪，樊海平*，廖碧钗，钟全福，林煜

(1.福建省淡水水产研究所；2. 福建省水产技术推广总站：福建 福州 350002)

地克珠利在鲫体内的药代动力学研究

林丽聪1，樊海平1*，廖碧钗2，钟全福1，林煜1

(1.福建省淡水水产研究所；2. 福建省水产技术推广总站：福建 福州 350002)

在(25±1) ℃水温条件下，按照鲫体质量为3.0 mg/kg的剂量，混饲投喂地克珠利,每天1次，连用5 d，并于第5天投喂后0.5、1、1.5、2、3、5、7、10、12、15、18、24、36、48、72、120、240、360、480、720、1 080、1 440、2 160、2 880、3 600 h采集鲫的血浆和肌肉样品，用高效液相色谱法测定血浆和肌肉中的药物浓度，研究了地克珠利在鲫体内的药代动力学特征。结果表明，鲫混饲投喂地克珠利后，其血浆和肌肉中地克珠利经时过程均符合一级吸收二室开放模型，其理论方程分别为C血浆=9.89e-6.710E-3t+3.66e-9.04E-4t-0.74e-4.379t，C肌肉=1.026e-6.379E-2t+0.1001e-1.53E-2t-1.82e-5.566t。鲫血浆和肌肉的达峰时间(Tmax)分别为11.11和11.00 h，峰浓度(Cmax)分别为30.58和1.108 mg/L，药时曲线下面积(AUC)分别为16 783和20.05 mg/(L·h )，消除半衰期(T1/2β)分别为827.6、45.41 h。实验结果表明地克珠利在鲫体内代谢缓慢。本研究为鲫的实际养殖过程中合理使用地克珠利提供理论依据，同时也为地克珠利在其他水产品中残留量的测定及药代动力学的研究提供技术支持。[中国渔业质量与标准，2017,7(1):16-21]

地克珠利；鲫；药代动力学；高效液相色谱

地克珠利(diclazuril)属于三嗪苯乙腈化合物，是由比利时Janssen公司于1986年研制开发的一种高效广谱抗球虫药[1]。因其高效、广谱、低毒性而在畜牧业生产中广泛使用[2]，在水产养殖业中也用于防治鲤科鱼类球虫、黏孢子虫等孢子虫病[3]。由于这类药物作用时间短，在生产养殖中会被长期重复用药、不合理用药或未严格遵守休药期，在动物体内产生药物残留，进而通过食物链传递，危害消费者健康。1998年，FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会(JECFA)研究了地克珠利在兔体内的毒物代谢动力学和致畸性实验，发现地克珠利在高剂量(1 280 mg/kg b.w.·d)时具有致畸性；大于320 mg/kg b.w.·d时有胎儿毒性但无致畸性[4]。目前，地克珠利在家兔、鸡组织中的残留和消除规律研究报道较多[5-15]，而在水产养殖上的应用研究较少。杨丽萍等[11-12]研究了地克珠利在家兔组织中的残留及消除规律，发现地克珠利在肾脏中残留量最高，且在肾脏中消除速度最快。张可煜等[15]研究了单次给药后雏鸡体内地克珠利的血药浓度，结果表明，地克珠利在雏鸡体内吸收比较快，消除缓慢。据报道，国内外已制定出畜禽组织中地克珠利的最高残留限量(MRL)：欧盟药品管理局(Regulation(EC) No 2377/90)规定地克珠利在羊、兔、禽肌肉中的最高残留限量为500 μg/kg；中国农业部公告235号也规定了地克珠利在禽肌肉中的最高残留限量为500 μg/kg[16-18]。2013年3月，欧洲兽用药品管理委员会(CVMP) 在报道[19]中指出由于没有用于检测有鳍鱼类肌肉中地克珠利残留量的方法，因而无法制定地克珠利在有鳍鱼类肌肉组织中的最高残留限量。因此，目前国内外均未制定地克珠利在鱼体组织中的最高残留限量。且国内仅见刘永涛等[20]建立了地克珠利在鱼体组织中残留量的超高效液相色谱检测方法。为此，本实验利用高效液相色谱法测定鲫体内的地克珠利浓度，研究其在鲫体内的药代动力学规律，为鲫养殖过程中合理使用该药提供理论依据，并为地克珠利在其他水产品中残留量的测定、药代动力学研究，及其在鱼体组织中的最高残留限量的制定提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

鲫(Carassiusauratus)，300尾，平均体重为(150±20)g，由福建省淡水水产研究所榕桥中试基地提供，经抽样检测，组织中无地克珠利残留。于10个不锈钢水族箱(每个箱体积为300 L，放水200 L)中饲养，每箱放鲫30尾，控制水温为(25±1)℃，不间断充气增氧。实验开始前一周停止投饵(饵料购自福州海马饲料有限公司，经检测无地克珠利残留)。地克珠利标准品(含量为99.9%)购自中国兽医药品监察所；地克珠利原料药(含量为98.0%)由重庆西南合成药业提供；乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

1.2 实验设计及采样

1.2.1 饵料的制备

准确称取地克珠利原料药1.0 g，加适量二甲亚砜溶解，加水对倍稀释至100 mL,均匀喷至1.0 kg饵料上，50 ℃烘干，饵料表面再喷一层花生油，烘干。

1.2.2 给药及样品采集

称取鱼体重，按3.0 mg/kg投饵量投喂，每天投喂1次，连续投喂5 d。并于第5天投喂后0.5、1、1.5、2、3、5、7、10、12、15、18、24、36、48、72、120、240、360、480、720、1 080、1 440、2 160、2 880、3 600 h采集血浆和肌肉样品，每个采样点采10尾鱼，5个平行。血浆、肌肉于-80 ℃保存备用。

1.3 色谱条件

高效液相色谱仪型号为Agilent 1200，带有多波长紫外检测器。色谱柱为Eclipse XDB-C18(4.6×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈:磷酸溶液(1 ∶1，V/V)，其中磷酸溶液由3.4 mL磷酸加水稀释至1 L而成；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；紫外检测波长为240 nm；进样量为50 μL。

1.4 样品处理

1.4.1 血浆样品

血浆样品解冻后，准确吸取1 mL置于15 mL离心管中，加入5 mL乙腈 ∶氯仿(9 ∶1，V/V)，再分别加入C18粉，中性氧化铝各200 mg，漩涡混合3 min，5 000 r/min离心5 min后，取上清液于50 ℃氮气吹干，残余物加1 mL流动相溶解，离心，过0.45 μm滤膜，待HPLC检测。

1.4.2 肌肉样品

肌肉样品解冻，匀浆，准确称取2.0 g于50 mL离心管中，加入2 g无水硫酸钠和4 mL乙腈，涡旋振荡5 min，5 000 r/min离心3 min后，吸取乙腈层到15 mL离心管中；残渣再加4 mL乙腈，重复提取1次，合并乙腈层，于50 ℃氮气吹干，加2 mL流动相溶解残留物后，加10 mL正己烷去脂，流动相层过0.45 μm滤膜，待HPLC检测。

1.5 标准曲线的制备

准确称取地克珠利标准品10 mg，置100 mL容量瓶中，加乙腈溶解并定容，使用时根据实验要求用流动相稀释至所需浓度的标准溶液。在1 mL空白血浆中加入适量已知浓度的标准溶液，使血浆中地克珠利浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 mg/L；在2.0 g空白肌肉中加入适量已知浓度的标准溶液，使肌肉中地克珠利含量分别为0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、0.50 mg/kg，按1.4方法处理并检测后，得到血浆和肌肉样品的标准工作曲线回归方程和相关系数。

1.6 回收率和精密度

1.6.1 回收率的测定

在空白样品中分别添加适量地克珠利标准溶液，配制成含地克珠利分别为0.05、0.10和0.5 0 mg/L的血浆样品和0.05、0.10和0.50 mg/kg 肌肉样品，每个添加水平5个重复，按1.4方法进行样品前处理，考察方法的回收率。

1.6.2 精密度的测定

对空白血浆样品在0.05、0.10和0.50 mg/L 3个浓度水平，空白肌肉在0.05、0.10和0.50 mg/kg 3个浓度水平上进行精密度实验，按1.4方法进行样品前处理后，每2小时测定一次，平行测定5次，计算日内变异系数。每天测定1次，平行测定5次，计算日间变异系数。

1.7 数据分析

将鲫血浆与肌肉样品中地克珠利药-时曲线采用PKSlover 1.0药动学软件进行药物动力学模型拟合及参数计算。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱图

在本实验选定的色谱条件下，地克珠利保留时间为15.1 min左右，且峰形尖锐，对称。空白血浆和肌肉中均无地克珠利峰。见图1。

图1 不同样品中地克珠利色谱图A：地克珠利标准品(0.5 mg·L-1)；B：在空白血浆中添加了地克珠利(0.5 mg·L-1)；C：空白血浆；D：在空白肌肉中添加了地克珠利(0.5 mg·kg-1)；E：空白肌肉；F：在空白肌肉中添加了地克珠利(定量限为40 μg·kg-1)。Fig.1 Chromatograms of diclazuril of different samplesA: The standard of diclazuril(0.5 mg·L-1); B: The blank plasma added diclazuril(0.5 mg·L-1); C: The blank plasma；D: The blank muscle added diclazuril(0.5 mg·kg-1); E: The blank muscle; F: The blank muscle added diclazuril(quantification limit： 40 μg·kg-1).

2.2 标准曲线及最低检测限

将1.5实验结果以峰面积(y)对质量浓度(x)作标准曲线，获得线性回归方程及相关系数(表1)。结果表明，鲫血浆在0.05～5.0 mg/L线性范围内，肌肉在0.05～5.00 mg/kg线性范围内，地克珠利线性关系良好。以引起3倍基线噪音的药物浓度为最低检测限，血浆中地克珠利的最低检测限为10 μg/L，定量限为40 μg/L；肌肉中的最低检测限为10 μg/kg，定量限为40 μg/kg。

表1 鲫血浆和肌肉中地克珠利的线性回归方程及相关系数

2.3 回收率及精密度

从表2可知，本实验条件下，地克珠利在鲫血浆的回收率为72.06%～80.21%，日内精密度为1.27%～2.45%，日间精密度为3.13%～5.01%；地克珠利在鲫肌肉中的回收率为72.98%～74.29%，日内精密度为1.76%～2.56%，日间精密度为2.17%～4.65%。上述实验结果符合残留检测方法对回收率与精密度的要求。

2.4 地克珠利在鲫体内的浓度变化及代谢动力学特征

按1.2方法给药后，鲫血浆和肌肉中地克珠利的含量变化见表3，主要药动学参数见表4。将地克珠利浓度-时间数据采用PKSlover 1.0药动学软件进行分析，结果显示，鲫连续投喂地克珠利5 d后血浆及肌肉中的药物经时过程均符合一级吸收二室开放模型，其理论方程为：C血浆=9.89e-6.710E-3t+3.66e-9.04E-4t-0.74e-4.379t，C肌肉=1.026e-6.379E-2t+0.1001e-1.53E-2t-1.82e-5.566t。

表2 空白样品中添加地克珠利的回收率及精密度

表3 地克珠利在鲫血浆和肌肉中的药物浓度

注：“ND”为未检出。

表4 地克珠利在鲫体内的药代动力学参数

注：A为分布相的零时截距；α为一级分布速率常数；B为消除相的零时截距；β为一级消除速率常数；Ka为吸收速率常数；T1/2α为分布半衰期；T1/2β为消除半衰期；T1/2ka为吸收半衰期；Tmax为达峰时间；Cmax为峰浓度；AUC为药时曲线下面积。

3 讨论与结论

本研究结果显示，在该实验条件下，鲫血浆和肌肉中地克珠利的药物代谢动力学过程均符合一级吸收二室开放模型。地克珠利在鲫血浆中的达峰时间为11.11 h,达峰浓度为30.58 mg/L，消除半衰期为827.6 h，而肌肉中达峰时间为11.00 h,达峰浓度为1.108 mg/kg，消除半衰期为45.41 h，可见地克珠利在血浆和肌肉中达峰时间相近，而血浆中峰浓度比肌肉中高出30倍左右，且消除较肌肉中缓慢得多。该研究结果表明地克珠利在鲫体内吸收比较迅速，但消除缓慢，属慢速消除药物，残留在机体内的药物增加了耐药性发生的可能性。因此，在生产应用中应采用轮换用药、穿梭用药等措施抑制耐药性的发生和药物残留。张可煜等[15]采用高效液相色谱法研究地克珠利在雏鸡体内的药动学，结果发现，地克珠利在雏鸡体内药物吸收快、消除慢，容易在体内蓄积；Meuldermans等[21-22]研究1 mg/kg b.w.) 剂量的14C标记地克珠利与乳糖混合物单次给药后在肉鸡、火鸡体内的代谢时，发现血液中药物浓度比组织中高2～l0倍。说明地克珠利在鲫体内的药动学特征与禽类类似。

通过研究地克珠利在鲫体内的药代动力学规律，从而为鲫养殖过程中合理使用该药提供理论依据，也为水产品中地克珠利的残留量的测定、药代动力学研究，及最高残留限量的制定提供技术支持。

[1] 张涛，张丽芳，薛飞群．液相色谱-串联质谱法测定鸡肝脏和肌肉中地克珠利残留量[J]. 中国农学通报，2010(15)：1-6．

[2] 宫小明，孙军，董静，等．高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉中的阿维菌素类、地克珠利、妥曲珠利及其代谢物残留[J].色谱， 2011，29(3)：217-222．

[3] 刘永涛，艾晓辉，李乐，等，超高效液相色谱法测定鱼体组织中地克珠利残留量[J]. 分析试验室， 2014,33(4)：420-423.

[4] JECFA. Toxicological Evaluation of Certain Veterinary Drug Residues in Food: Diclazuril. WHO Food Additives Series 41, Geneva 1998.

[5] 林仙军，陆春波，包爱情，等． 高效液相色谱法测定鸡肌肉中地克珠利、妥曲珠利及其代谢物的残留量[J]. 中国兽药杂志， 2015，49(3)：53-57．

[6] 罗浩师，张丽芳，薛飞群．高效液相色谱-串联质谱法测定鸡脂肪中地克珠利残留量[J]. 中国家禽， 2012，34(20)：14-17．

[7] 张涛，张丽芳，江善祥．液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中地克珠利的残留量[J]. 安徽农业科学， 2009(14)：6314-6316．

[8] 文丽，方炳虎．地克珠利在健康鸡及球虫感染鸡体内残留的比较研究[J]. 中国兽药杂志， 2008，42(1)：15-17．

[9] 施祖灏，朱良强，卢运站，等．鸡组织中地克珠利和妥曲珠利残留HPLC检测方法的建立[J].中国兽医学报， 2009，29(1)：79-81．

[10] 舒刚，叶连娟，杨乐，等．地克珠利肠溶微囊在家兔体内的药代动力学研究[J].中国兽医科学， 2013，43(6)：639-644．

[11] 杨丽萍，高淑霞，孙海涛，等．液相色谱-串联质谱法研究地克珠利在家兔组织中残留及消除规律[J]. 畜牧与饲料科学， 2011，32(12)：6-8．

[12] 杨丽萍，高淑霞，张秀玲，等．HPLC法检测家兔血浆中地克珠利含量[J]. 中国兽药杂志， 2011，45(10)：25-27．

[13] 王国永，赵振升，薛帮群，等．地克珠利在獭兔体内的药物动力学研究[J].中国养兔，2007(5)：22-25．

[14] 舒刚，叶连娟，杨乐，等．地克珠利肠溶微囊在家兔体内的药代动力学研究[J]. 中国兽医科学， 2013，43(6)：639-644．

[15] 张可煜，王国永，赵振升，等． 地克珠利在雏鸡体内的药动学研究[J]. 中国兽医寄生虫病， 2008，16(2)：1-4．

[16] European Union. Commission Implementing Regulation(EU) No 115/2013 [EB/OL]. (2013-02-08).http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2013:038:0011:0013:EN:PDF

[17] 农业部．中华人民共和国农业部公告第235号[EB/OL]. (2002-12-24). http://www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/gg/200302/t20030226_59300.htm

[18] Codex Alimentarius Commission．Maximum Residue Limits for Veterinary Drugs in Foods[EB/OL].(2012-07-01).http://doc.mbalib.com/view/45cbdbed1ebc3d 5acc6179e485c2ded0.html

[19] European Medicines Agency． European public MRL assessment report (EPMAR)[EB/OL]. (2013-03-04).http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Maximum_Residue_Limits_-_Report/2013/03/WC500139599.pdf

[20] 刘永涛，艾晓辉，李乐，等，超高效液相色谱法测定鱼体组织中地克珠利残留量[J]. 分析试验室， 2014,33(4)，420-423.

[21] Meuldermans W，Michiels M，Hendrickx J，et a1．14C- Diclazuril(14C-R64433)in the broiler chicken：Total radioactivity depletion and metabolism after single oral administration at 1 mg/kg．Unpublished preclinical research report[D]．Belgium: WHO，1988．

[22] Meuldermans W，Van Bei Jsterveld L，Hendrickx J，et a1．14C-Diclazuril(14C-R64433)in the turkey：Absorption，metabolism ，excretion and tissue depletion after a single oral dose of 1 mg/kg．Unpublished preclinical research report on R64433[D]．Belgium: WHO，1990．

Pharmacokinetics of diclazuril inCarassiusauratus

LIN Licong1，FAN Haiping1*，LIAO Bichai2，ZHONG Quanfu1，LIN Yu1

(1.The Freshwater Fisheries Research Institute of Fujian Province;2. Fujian Fishery Technical Extension Center: Fuzhou 350002, China)

At water temperature of (25±1) ℃,Carassiusauratuswas treated by oral administration of diclazuril in dose of 3 mg/kg once a day for 5 d. The concentration of diclazuril in the plasma and muscle ofCarassiusauratusat 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 5, 7, 10, 12, 15, 18, 24, 36, 48, 72, 120, 240, 360, 480, 720, 1 080, 1 440, 2 160, 2 880 and 3 600 h after feeding were determined by high performance liquid chromatography, and the pharmacokinetics of diclazuril inCarassiusauratuswere studied．The results showed that following oral administration, the plasma and muscle concentration-time course of diclazuril both conformed to a two-compartment open model with the first order absorption. The pharmacokinetic equations were as follows,Cplasma=9.89e-6.710E-3t+3.66e-9.04E-4t-0.74e-4.379t,Cmuscle=1.026e-6.379E-2t+0.1001e-1.53E-2t-1.82e-5.566t. The time to peak (Tmax) of diclazuril in plasma and muscle were 11.11 and 11.00 h, respectively, and the peak concentration (Cmax) were 30.58 and 1.108 mg/L, respectively, and the area under the concentration-time curve (AUC) were 16 783 and 20.05 mg/(L·h ), respectively, and the elimination half-life(T1/2β)were 827.6 and 45.41 h, respectively.The results showed that diclazuril was eliminated slowly fromCarassiusauratus. This study provided theoretical basis for the actual breeding ofCarassiusauratuswith diclazuril, and technical support for the determination of residues and pharmacokinetic study of diclazuril in the other aquatic products. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(1):16-21]

diclazuril;Carassiusauratus; pharmacokinetics; high performance liquid chromatography

FAN Haiping, fanhaiping16@163.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.01.003

2016-06-15；接收日期：2016-10-15

现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-46-35)

林丽聪(1982-)，女，硕士，高级工程师，研究方向为水产品药物代谢动力学与质量安全， linlicong82@163.com 通信作者：樊海平，研究员，研究方向为水产养殖动物病害防治，fanhaiping16@163.com

S94

A

2095-1833(2017)01-0016-05