薛菲+刘顺刚+张祥胜

摘要：以盐地碱蓬叶为试材，采用双酶法从中提取可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）。通过单因素试验及正交试验研究不同提取条件对碱蓬叶中SDF提取率的影响；通过测定羟自由基清除率、还原力和DPPH自由基清除率鉴定其抗氧化性。结果表明，双酶法提取SDF的最佳工艺条件为料液比1 g ∶25 mL、木瓜蛋白酶用量16%、酶解时间3 h、酶解温度55 ℃、糖化酶用量1.0%；提取液具有显著的羟自由基清除率、DPPH自由基清除能力和铁还原力。

关键词：盐地碱蓬叶；可溶性膳食纤维；抗氧化；正交试验；提取工艺

中图分类号： TS201.4 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0175-03

盐地碱蓬（Suaeda salsa）为藜科、碱蓬属草本植物，别称盐蓬、黄须菜、盐蒿，是典型的盐地指示植物。幼苗可作蔬菜，种子可榨油。富含不饱和脂肪酸、维生素和微量元素，具有降糖、降压、扩张血管、防治心脏病和增强人体免疫力等药用效能[1]。膳食纤维一般指包含纤维素、半纤维素、树脂、果胶及木质素等成分，在人体中不易被消化吸收的多糖类食物成分，主要存在于植物的细胞壁中。根据膳食纤维的溶解性不同，它包括可溶性膳食纤维（SDF）和不溶性膳食纤维（IDF）[2-3]。膳食纤维对人的生理具有积极的促进作用，包括通便、降血脂、降血糖等[4]。近年来，对盐地碱蓬叶化学成分方面的研究，主要为无机元素，而有机成分仅限于对其营养成分和总黄酮提取测定方面的研究，关于其中SDF提取工艺及其抗氧化活性方面极少，因此，本试验主要研究盐地碱蓬叶中SDF的提取条件，通过优化条件，获得最高提取率，并通过不同方法评价其提取物的抗氧化性，旨在为盐地碱蓬叶作为天然抗氧化剂来源的可行性开发提供前期准备。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试碱蓬叶，采摘于江苏省盐城市滩涂自然保护区。供试药剂有木瓜蛋白酶（100 000 U/g）、糖化酶（100 000 U/g），江苏锐阳生物科技有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、无水乙醇等均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 盐地碱蓬叶中SDF提取工艺流程 碱蓬叶干燥至恒质量→粉碎→过筛（40目）→称取样品1 g→加磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH值为6.6）溶解、调pH值至7.0→加入植物蛋白酶酶解→灭酶（100 ℃，5 min）→调pH值至4.0～4.6、加入糖化酶、酶解（酶解温度60 ℃）→灭酶（100 ℃，5 min）→（用2层纱布过滤）离心（9 000 r/min，4 min）取滤液浓缩至 5 mL→醇析（4倍体积95%热乙醇）→离心（9 000 r/min，4 min）、取滤渣、洗涤滤渣（用丙酮、78%乙醇）→干燥至恒质量，即得SDF，计算SDF提取率[4-5]。

1.2.2 SDF提取率的计算 SDF提取率=[提取所得的SDF质量（g）/样品质量（g）]×100%。

1.2.3 盐地碱蓬叶SDF提取条件优化 选取对SDF提取率有影响的料液比、植物蛋白酶酶解时间、植物蛋白酶添加量、植物蛋白酶酶解温度、糖化酶添加量等5个因素，在单因素试验的基础上，做5因素4水平的正交试验，考察其对SDF提取率的影响（表1）。

1.2.4 盐地碱蓬叶中SDF提取物抗氧化活性研究

1.2.4.1 羟自由基清除率的测定 羟自由基的清除能力是体外常用的评估抗氧化方法之一[6]。本试验采用紫外分光光度法，取9 mmol/L的FeSO4溶液1 mL，8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL，9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液1 mL，加入不同浓度的SDF提取液1 mL，静置30 min，用蒸馏水作空白对照，510 nm处测量其吸光度，代入以下公式计算[7-8]：

清除率=[1-（D1-D2）/D3]×100%。

式中：D1表示加了样液的吸光度；D2表示不加显色剂的样液的本底吸光度，是为了减去样液本身颜色对于试验的影响；D3表示以蒸馏水代替样液的空白管的吸光度。

1.2.4.2 还原力的测定 取1 mL不同浓度的SDF提取液分别置于试管中，依次加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH值为6.6）0.2 mL和1%铁氰化钾溶液0.5 mL，50 ℃水浴 20 min，快速冷却后加入10%三氯乙酸溶液1 mL，以 2 000 r/min 的转速离心10 min，取上清液1.5 mL，加入3 mL蒸馏水和0.1% FeCl3溶液1 mL，以蒸馏水作为空白对照，充分混匀，静置10 min后，在700 nm下测定其吸光度值D[9]。

1.2.4.3 DPPH自由基清除率的测定 取不同料液比的SDF提取液各1.0 mL加入试管中，加含0.057 mg/mL DPPH自由基的乙醇溶液1.0 mL，置于暗处反应30 min，在517 nm波长处测定吸光度，以蒸馏水作为空白，计算清除率[10-11]。

清除率=[1-（Di-Dj）/D0]×100%。

式中：Di表示1 mL提取液+1 mL DPPH溶液的吸光度；Dj表示1 mL提取液+1 mL无水乙醇的吸光度；D0表示1 mL DPPH+1 mL无水乙醇的吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对SDF提取率的影響 设定植物蛋白酶添加量12%，称取1 g样品，在50 ℃下酶解4 h，糖化酶添加量 1.0%，分别按照料液比1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g ∶mL）提取SDF，考察料液比对SDF提取率的影响（图1）。

由图1可知，随着溶剂的量的增大，SDF提取率先上升后下降，且在1 g ∶15 mL处时提取率最高，为16.21%。因此，确定设计料液比在1 g ∶15 mL左右为宜。可能是因为溶剂过少时溶解度低，反应体系较为黏稠，酶与底物接触不够充分；但当溶剂过多时，底物浓度过低，酶被稀释，使底物与酶之间的结合受阻，因此SDF提取率随着溶剂的量的增大呈先升后降的趋势。

2.1.2 植物蛋白酶添加量对SDF提取率的影响 设定料液比为1 g ∶15 mL，糖化酶添加量1.0%，分别按8%、12%、16%、20%、24%的植物蛋白酶添加量，50 ℃下酶解4 h，计算SDF提取率（图2）。由图2可知，随着植物蛋白酶添加量的提高，SDF提取率先增加后降低，且在添加量为16%时，达到最大提取率 18.66%。可能是因为植物蛋白酶增加后，使底物与酶反应更彻底，所以SDF提取率越来越高；而继续增加植物蛋白酶量时，过多的酶反而抑制了反应的进行，致使SDF提取率反而降低。所以植物蛋白酶添加量在16%时最佳。

2.1.3 植物蛋白酶酶解时间对SDF提取率的影响 设定料液比为1 g ∶15 mL，糖化酶添加量1.0%， 植物蛋白酶添加量16%，酶解温度50 ℃，分别酶解2、3、4、5、6 h，计算SDF提取率（图3）。由图3可知，随着植物蛋白酶酶解时间的增加，SDF提取率先增加后降低，且在3 h时SDF提取率最大，为21.15%。可能是因为随着酶解时间的增加，碱蓬叶中的SDF被充分提取出来，而随着时间越来越长，SDF暴露在空气中被氧化，提取量反而减少。因此蛋白酶酶解时间3 h为最佳提取条件。

2.1.4 植物蛋白酶酶解温度对SDF提取率的影响 设定料液比为1 g ∶15 mL，糖化酶添加量1.0%，植物蛋白酶添加量16%，酶解3 h，分别于40、45、50、55、60 ℃对蛋白酶进行酶解提取SDF，考察植物蛋白酶酶解温度对SDF提取率的影响（图4）。由图4可知，随着酶解温度的提高，SDF提取率先增加后降低，且在50 ℃时最大，达19.29%。可能是因为随着酶解温度提高，植物蛋白酶的活性也越来越高，从而SDF的提取率增加，而当酶解温度超过最适温度后，蛋白酶渐渐失活，提取率也降低。所以50 ℃为适宜的蛋白酶酶解温度。

2.1.5 糖化酶添加量对SDF提取率的影响 设定料液比为1 g ∶15 mL，植物蛋白酶添加量15%，50 ℃酶解3 h，分别加入糖化酶0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%，考察其添加量对SDF提取率的影响（图5）。由图5可知，随着糖化酶添加量的提高，SDF提取率先增加后降低，且当添加量为1.0%时，提取率达到19.68%。因此，确定糖化酶添加量在1.0%时为最佳提取条件。

2.2 正交试验结果

由表2可知，因为RA>RB>RC>RD>RE，所以各因素对SDF提取率影响的大小依次为A>B>C>D>E，各种因素的k值表明各因素水平的影响程度分别是A4>A3>A2>A1，B3>B4>B2>B1，C2>C4>C3>C1，D3>D4>D1>D2，E3>E4>E2>E1，各因素水平的最佳组合为A4B3C2D3E3，即碱蓬叶中SDF提取的最佳条件为料液比1 g ∶25 mL，植物蛋白酶添加量为16%，酶解时间为3 h，酶解温度为55 ℃，糖化酶添加量为 1.0%。

2.3 盐地碱蓬叶中SDF的抗氧化作用

2.3.1 羟自由基清除率的测定 不同料液比的SDF提取液对羟自由基的清除作用见图6。由图6可知，料液比分别为 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g ∶mL）的提取液清除自由基时，它的羟自由基清除率随着料液比的增加而降低，与样品的浓度呈正相关，当样品浓度达到一定程度时，羟自由基清除率将趋于稳定，这与张志旭等的研究结果[12]一致。

2.3.2 还原力的测定 对不同料液比的SDF提取液测其吸光度，吸光度D值越大，表示还原力越强，其相应的还原力测定值见图7。由图7可知，随着料液比的增加，它的吸光值呈下降趋势，说明盐地碱蓬叶中可溶性膳食纤维随着料液比的增加还原力降低。

2.3.2 DPPH自由基清除率的测定 DPPH自由基是一种稳定的自由基，根据吸光度的变化可测得样品中清除率的大小[13]。不同料液比的SDF提取液其对DPPH自由基的清除作用见图8。由图8可知，不同料液比的SDF溶液对DPPH自由基清除能力呈正相关关系，随着料液比的增加，DPPH自由基清除率越小。

3 结论

该试验以盐地碱蓬叶中的SDF提取率为指标，采取单因素试验，确定单因素的合适范围，在此基础上进行正交试验优化提取工艺。结果表明，各因素水平的最佳组合为A4B3C2D3E3，即碱蓬叶中SDF提取的最佳条件为料液比 1 g ∶25 mL，植物蛋白酶添加量为16%，酶解时间为3 h，酶解温度为55 ℃，糖化酶添加量为1.0%。通过羟自由基清除率、还原力和DPPH自由基清除率鉴定其提取液的抗氧化性，提取液具有显著的羟自由基清除率、DPPH自由基清除能力和铁还原力，为其作为功能性食品开发提供了参考。

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