于盛竹，成华峰

(1.东北农业大学 资源与环境学院，哈尔滨 150030； 2.黑龙江省家畜遗传资源保护中心 150069)

猪性控精子的筛选方法介绍

于盛竹1，成华峰2

(1.东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨150030； 2.黑龙江省家畜遗传资源保护中心150069)

细胞染色技术的改进以及采用荧光染料标记活精子的DNA为筛选X或Y精子，进而生产性控后代提供了重要的技术保障。采用流式细胞仪/细胞分选系统筛选精子，虽然其原理依然是X和Y精子DNA含量不同，但对细胞分选系统进行一定程度的改进，以便能够更准确地测定X和Y精子DNA含量的差别。以前的“标准”细胞分选系统样品是在0.84 kg/cm2的压力下测定的，分选速度为350 000个精子/h。后来人们改进了细胞分选系统，样品是在0.84～4.22 kg/cm2的压力下筛选的，分选速度为每小时6×106个X精子和6×106个Y精子，如果只分选X精子(纯度为85%)或Y精子(纯度为90%)，则分选速度可达到1.1×107个/h。

1 筛选精子性别进行性控的基本方法

精子样品的制备：最为关键的是制备过程中对精子的损伤越小，分选的精子数量越多，受精能力越强。制样过程中可能对精子造成损伤的环节主要有精液中加入染料、精子进入分选系统时压力的变化等。采用高速分选系统时，可将精液制备成每毫升含1.5亿个精子，标准分选系统时其量加大10倍，按比例以8 μL/mL(5 mg/mL母液)的速度加入Hoechst 33342，然后在35℃条件下温育1 h，以便使染料能均匀通过细胞膜，减少测定误差。

分选精子的收集：收集分选精子时最为重要的是精子活力的保存。在精子分选过程中样品的稀释倍数应该越小越好。分选精液的精子浓度应该低于1.5亿/mL(射出精液的浓度一般为：猪3亿/mL；牛10亿/mL)。当荧光染色的精子进入流式细胞仪测定室时，其周围包有一层由含0.1%BSA的PBS组成的保护层，PBS可以增加稀释效果，BSA可以减少精子的凝集。分选时可将精子分选进入含卵黄的稀释液中，20%的TEST-卵黄的稀释效果更好。标准分选系统可采用0.5 mL小管(含50 μL 20%TEST-卵黄)，高速分选系统可用15 mL试管(含500 μL 20%TEST-卵黄)。分选时，精子进入该试管，而活精子则继续其向下运动进入试管底部的TEST-卵黄稀释液中。分选结束后将收集的精液样品以(350～750)g的速度离心10 min，然后精液就可用来进行AI后IVF。整个分选是在室温下进行的。分选的精子要进行IVF时，TEST-卵黄中卵黄的比例可降低到5%以下，太高将会干扰IVF时的受精过程。一般采用的卵黄浓度为2%。在分选系统的稀释液中也可加入同种动物的精清，但有研究表明，在2%的TEST-卵黄加入10%的精清可使表现顶体反应精子的百分比降低。分选的精子会提前获能，这种情况与猪精子在冷冻时的反应相似。虽然发生这种变化不利于精子的保存，但由于事实上精子已经是获能的，因此可马上用来进行IVF。采用这种技术筛选的精子纯度可以达到95%。对一些DNA含量差异大的动物，例如南美栗鼠，为7.5%，纯度可以达到100%。一般来说，DNA含量差别超过3.5%时可以获得很高的纯度，但死精子、形态异常的精子及精子头部的形状可能会影响筛选结果。

筛选精子性别的验证：在分选过程中或在其完成之后，可用一预先用BSA浸泡过的试管收集部分分选过的样品，但不需要加入TEST-卵黄，然后用超声波处理除去精子尾部，加入Hoechst 33342并保持染色的均匀性，再用流式细胞仪测定精子性别。也可采用FISH技术测定携带Y微卫星DNA的Y精子鉴别，两者之间的准确性没有明显差别。此外，也可采用PCR技术。但FISH和PCR技术需要3～4 h，而测定DNA含量的流式细胞仪方法只需要30 min。

2 分选精子的生育能力

在猪采用输卵管内输精及IVF技术进行试验，所产仔猪均为预选性别。采用IVF技术后卵裂率为56%，将2～4细胞阶段的胚胎移植，所有移植的胚胎均为筛选的X精子IVF所得，所产仔猪均为雌性。在采用分选精子进行IVF时应该注意，在精子分选后尽快进行IVF，因为分选过程可能加快了精子的获能。虽然也可在分选后较长时间进行IVF，但精子活力明显降低。

性控精子在养猪业和养牛业中具有极其广泛的应用前景。结合采用IVF/ET技术就可以产生一窝同性别的猪，在猪也可采用手术输精和腹腔镜输精的方法将性控精液输到受精部位。猪的常规AI技术每输精剂量需要3亿精子，这一剂量基本不可能在性控精液中采用，因此目前人们正在研究采用低剂量输精的技术，例如可采用内窥镜将少量精液输到宫-管结合部。目前取得的结果是比较令人满意的，也可采用这种技术用性控精液输精。对猪受精最少需要精子数量的研究表明，如果将精液输到子宫远端，则只需要1千万个精子。从这些研究结果可以看出，如果在养猪业中采用AI技术，就很有必要对最少的输精剂量进行研究，如果能将每次输精的精子数量降低到5百万以下，则完全可以采用性控精液。

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