阿立哌唑对Aβ25-35诱导的神经PC12细胞损伤的影响及机制

2017-02-18杨淑珍赵晶媛新乡医学院第二附属医院精神七科河南新乡453002

中国药房 2017年1期

杨淑珍，赵晶媛（新乡医学院第二附属医院精神七科，河南新乡 453002）

杨淑珍＊，赵晶媛#（新乡医学院第二附属医院精神七科，河南新乡 453002）

目的：研究阿立哌唑对Aβ淀粉样蛋白（Aβ25-35）诱导的神经PC12细胞损伤的影响及其机制。方法：将PC12细胞随机分为正常对照组、模型组（20 μmol/LAβ25-35）和阿立哌唑低、中、高浓度组（5、10、20 μmol/L阿立哌唑+20 μmol/LAβ25-35），加入含相应药物的培养基培养48 h，每组6个复孔。MTT法检测细胞活力（光密度值），Hoechst染色法检测细胞凋亡情况，分光光度法检测细胞中天冬氨酸特异性蛋白酶3（Caspase-3）、Caspase-9活性，Western blot法检测细胞中B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）蛋白表达及蛋白激酶B（Akt）磷酸化水平。结果：与正常对照组比较，模型组细胞光密度值降低，凋亡率增加，Caspase-3、Caspase-9活性和Bax蛋白表达均增强，Bcl-2、PI3K蛋白表达和Akt磷酸化水平均降低（P＜0.01）。与模型组比较，阿立哌唑低、中、高浓度组细胞光密度值增加，凋亡率减少，Caspase-3、Caspase-9活性减弱，Bcl-2、PI3K蛋白表达和Akt磷酸化水平均增加；阿立哌唑中、高浓度组细胞Bax蛋白表达减弱（P＜0.05或P＜0.01）。结论：阿立哌唑可明显抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡，其作用可能与激活PI3K/Akt信号通路有关。

阿立哌唑；Aβ淀粉样蛋白；神经PC12细胞；凋亡；磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）又称老年痴呆症，是一种中枢神经系统变性疾病，临床主要表现为认知功能障碍、行为及活动能力下降或异常。其中脑内及海马区Aβ淀粉样蛋白（Amyloid β-protein，Aβ）沉积是AD主要病理变化之一，已成为AD治疗药物的主要靶点之一[1-2]。PC12细胞是来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的一种常用的神经细胞，其形态、结构及生化功能与神经元类似，常作为研究神经细胞生长、凋亡、发育及功能的细胞培养模型。Aβ诱导的PC12细胞损伤模型已被广泛使用于AD等神经性疾病的探讨研究[3-4]。阿立哌唑是一种非典型抗精神病药物，能通过激活多巴胺受体改善精神分裂症状及抑郁症。同时临床研究证实，阿立哌唑单独用药或者联用其他非典型抗精神病药物对AD患者疗效显著[5-6]。基础研究也证实，阿立哌唑对PC12细胞活力或者1-甲基-4-苯基吡啶离子（MMP+）诱导的PC12细胞损伤具有显著影响[7-8]，但具体作用机制尚未见报道。所以，本研究拟以Aβ25-35诱导PC12细胞损伤，探讨阿立哌唑的抗损伤作用及具体机制。

1 材料

1.1 仪器

Tecan Infinite F200/M200型多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）；ChemiDocTMXRS型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；AF6000型荧光显微镜（德国Leica公司）。

1.2 药品与试剂

阿立哌唑口腔崩解片（浙江大冢制药有限公司，批号：140910A，规格：5 mg/片）；Aβ25-35（美国Sigma公司，批号：A4559，纯度：＞95%）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（批号：P0010）、小鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（H+L）、HRP标记山羊抗小鼠IgG（H+L）、Hoechst染色试剂盒（碧云天生物技术研究所）；兔抗B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化（p-）Akt单克隆抗体（美国Epitmics公司）；天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、Caspase-9活性检测试剂盒（南京凯基生物科技有限公司）；DMEM培养基（美国Gibco公司）。

1.3 细胞

大鼠神经PC12细胞购于中国科学院上海细胞库，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。

2 方法

2.1 分组与给药

按文献[9-11]方法将试验分为正常对照组、模型组（20 μmol/L Aβ25-35）和阿立哌唑低、中、高浓度组（5、10、20 μmol/L阿立哌唑+20 μmol/LAβ25-35），加入含相应药物的DMEM培养基培养48 h，每组6个复孔。

2.2 细胞活力的检测

将处于生长对数期的PC12细胞消化，调细胞密度为5×103mL－1，接种于96孔板，每孔200 μL，于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h。按“2.1”项下分组给药，继续培养48 h，每孔加MTT（5 mg/mL）20 μL，4 h后弃上清，并每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL培养10 min。用酶标仪于570 nm波长处测定光密度（OD值），以此评价细胞活力。

2.3 细胞凋亡的检测

将融合度为80%的PC12细胞消化，调细胞密度为1×104mL－1，接种于6孔板，每孔1 mL，于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h，按“2.1”项下分组给药，继续培养48 h。然后按照Hoechst染色试剂盒说明书进行染色，固定，显微镜下观察细胞核，发亮发白即是凋亡细胞。利用Image J软件计算各组细胞的细胞凋亡率（%）。

2.4 细胞中Caspase-3、Caspase-9活性的检测

将融合度为80%的PC12细胞消化，调细胞密度为1×104mL－1，接种于6孔板，每孔1 mL，于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h。按“2.1”项下分组给药，继续培养48 h，然后按照Caspase-3、Caspase-9活性检测试剂盒说明书操作，用酶标仪于405 nm波长处测定吸光度，计算活性。

2.5 凋亡相关因子和PI3K/Akt信号通路相关因子的检测

将融合度为80%的PC12细胞消化，调细胞密度为1×104mL－1，接种于6孔板，每孔1 mL，于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h。按“2.1”项下分组给药，继续培养48 h，收集细胞，加入RIPA裂解液，裂解30 min。以离心半径为15 cm、10 000 r/min离心10 min，收获蛋白。采用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。蛋白样品煮沸变性10 min，上样，进行十二烷基硫酸钠凝胶电泳1～2 h，湿法转膜30～40 min，加入一抗（兔抗Bax、Bcl-2、PI3K、Akt、p-Akt单克隆抗体，小鼠抗GAPDH单克隆抗体，稀释比例均为1∶100）孵育，4℃过夜。漂洗后，加入二抗[HRP标记山羊抗兔IgG（H+L）、HRP标记山羊抗小鼠IgG（H+L），稀释比例均为1∶500]，室温孵育1～2 h。漂洗并滴加增强化学发光（ECL）液后，在凝胶成像系统中曝光，用Quantity One软件统计各抗体条带灰度值。以Bcl-2、Bax、PI3K与GADPH灰度值的比值表示对应蛋白的相对表达量，以p-Akt与Akt灰度值的比值表示Akt的磷酸化水平。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 细胞活力的测定结果

与正常对照组比较，模型组细胞的OD值降低（P＜0.01）。与模型组比较，阿立哌唑各浓度组细胞的OD值均增加（P＜0.01）。与阿立哌唑低浓度组比较，阿立哌唑中、高浓度组细胞的OD值均增加（P＜0.01）；与阿立哌唑中浓度组比较，阿立哌唑高浓度组细胞的OD值增加（P＜0.01）。各组细胞活力的测定结果见表1。

3.2 细胞凋亡率的测定结果

与正常对照组比较，模型组细胞凋亡率增加（P＜0.01）。与模型组比较，阿立哌唑各浓度组细胞凋亡率减少（P＜0.05或P＜0.01）。与阿立哌唑低浓度组比较，阿立哌唑中、高浓度组细胞凋亡率减少（P＜0.01）；与阿立哌唑中浓度组比较，阿立哌唑高浓度组细胞凋亡率减少（P＜0.01）。各组细胞凋亡情况的Hoechst染色图见图1，凋亡率测定结果见表1。

表1 各组细胞活力和凋亡率的测定结果（±s，n＝6）Tab 1 Results of cell viability and apoptotic rate in each group（±s，n＝6）

注：与正常对照组比较，＊＊P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与阿立哌唑低浓度组比较，ΔΔP＜0.01；与阿立哌唑中浓度组比较，▲▲P＜0.01Note：vs.normal control group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01；vs.aripiprazole low-concentration group，ΔΔP＜0.01；vs.aripiprazole medium-concentration group，▲▲P＜0.01

组别正常对照组模型组阿立哌唑低浓度组阿立哌唑中浓度组阿立哌唑高浓度组细胞凋亡率，% 5.38±0.54 38.46±2.54＊＊27.72±2.56#17.48±1.74##ΔΔ9.59±0.98##ΔΔ▲▲OD值0.67±0.06 0.34±0.03＊＊0.43±0.05##0.52±0.05##ΔΔ0.63±0.06##ΔΔ▲▲

图1 各组细胞凋亡情况（Hoechst染色，×200）Fig1 Cell apoptosis in each group（Hoechst staining，×200）

3.3 细胞中Caspase-3、Caspase-9活性的测定结果

与正常对照组比较，模型组细胞中Caspase-3、Caspase-9活性增强（P＜0.01）。与模型组比较，阿立哌唑各浓度组细胞中Caspase-3、Caspase-9活性减弱（P＜0.05或P＜0.01）。与阿立哌唑低浓度组比较，阿立哌唑中、高浓度组细胞中Caspase-3、Caspase-9活性减弱（P＜0.01）；与阿立哌唑中浓度组比较，阿立哌唑高浓度组细胞中Caspase-3、Caspase-9活性减弱（P＜0.01）。各组细胞中Caspase-3、Caspase-9活性的测定结果见表2。

3.4 细胞中Bax、Bcl-2、PI3K蛋白表达和Akt磷酸化水平的测定结果

与正常对照组比较，模型组细胞中Bcl-2、PI3K蛋白表达减弱，Bax蛋白表达增强，p-Akt/Akt降低（P＜0.01）。与模型组比较，阿立哌唑各浓度组细胞中Bcl-2、PI3K蛋白表达增强和p-Akt/Akt增加，阿立哌唑中、高浓度组细胞中Bax蛋白表达减弱（P＜0.05或P＜0.01）。与阿立哌唑低浓度组比较，阿立哌唑中、高浓度组细胞中Bcl-2、PI3K蛋白表达增强和p-Akt/Akt增加，Bax蛋白表达减弱（P＜0.01）；与阿立哌唑中浓度组比较，阿立哌唑高浓度组细胞中Bcl-2、PI3K蛋白表达增强和p-Akt/ Akt增加，Bax蛋白表达减弱（P＜0.01）。各组细胞中Bax、Bcl-2、PI3K蛋白表达及Akt磷酸化水平的电泳图见图2，测定结果见表3。

表2 各组细胞中Caspase-3、Caspase-9活性的测定结果（±s，n＝6）Tab 2 Results of the activities of Caspase-3 and Caspase-9 in cell of each group（±s，n＝6）

注：与正常对照组比较，＊＊P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与阿立哌唑低浓度组比较，ΔΔP＜0.01；与阿立哌唑中浓度组比较，▲▲P＜0.01Note：vs.normal control group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01；vs.aripiprazole low-concentration group，ΔΔP＜0.01；vs. aripiprazole medium-concentration group，▲▲P＜0.01

组别正常对照组模型组阿立哌唑低浓度组阿立哌唑中浓度组阿立哌唑高浓度组Caspase-9 0.29±0.02 2.38±0.24＊＊1.95±0.20#1.23±0.12##ΔΔ0.74±0.07##ΔΔ▲▲Caspase-3 0.48±0.04 3.27±0.30＊＊2.72±0.26##2.08±0.20##ΔΔ1.23±0.13##ΔΔ▲▲

图2 各组细胞中Bax、Bcl-2、PI3K蛋白表达及Akt磷酸化水平的电泳图Fig 2 Electrophoresis of protein expressions of Bax，Bcl-2 and PI3K and the phosphorylation of Akt in cell of each group

表3 各组细胞中Bax、Bcl-2、PI3K蛋白表达及Akt磷酸化水平的测定结果（±s，n＝6）Tab 3 Determination results for protein expressions of Bax，Bcl-2 and PI3K and the phosphorylation ofAkt in cell of each group（±s，n＝6）

组别正常对照组模型组阿立哌唑低浓度组阿立哌唑中浓度组阿立哌唑高浓度组p-Akt/Akt 0.83±0.08 0.08±0.01＊＊0.19±0.02##0.37±0.03##ΔΔ0.38±0.03##ΔΔBax/GADPH 0.15±0.01 1.34±0.13＊＊1.32±0.05 0.88±0.09##ΔΔ0.40±0.04##ΔΔ▲▲Bcl-2/GADPH 1.29±0.12 0.21±0.02＊＊0.37±0.03#0.93±0.10##ΔΔ1.14±0.10##ΔΔ▲▲PI3K/GADPH 0.62±0.06 0.18±0.01＊＊0.30±0.03##0.41±0.04##ΔΔ0.42±0.37##ΔΔ

4 讨论

本研究首先通过MTT法检测阿立哌唑对Aβ25-35诱导的PC12细胞的影响，结果表明阿立哌唑能浓度依赖性地提高PC12细胞活力，进一步的Hoechst染色结果也证实阿立哌唑能抵抗Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡，由此提示阿立哌唑能抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡，并促进细胞存活。

细胞凋亡由多种信号通路所调控，PI3K/Akt信号通路就是其中之一，具有“抗凋亡通路”之称。当PI3K被激活后，可促使3，4-二磷酸脂酰肌醇（PIP2）转化为3，4，5-三磷酸脂酰肌醇（PIP3），后者招募并激活Akt，活化的Akt通过磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白如Bax、Bcl-2及Caspase表达，进而调节细胞的增殖、分化及凋亡等过程。Bcl-2是最常见的抑凋亡蛋白，能与促凋亡蛋白Bax形成异源二聚体，从而作用于线粒体膜上，促进细胞色素C及Caspase-3与Caspase-9的释放，最终诱导细胞凋亡。已有研究证实，Aβ能促使神经元细胞Bcl-2表达减弱、Bax表达增强，使Bcl-2/Bax比值降低[12]；同时Aβ25-35可诱导PC12细胞中Bcl-2表达下调、Bax表达上调、Caspase-3活性增强[10，13]；另外Aβ可降低AD大鼠脑组织中PI3K/Akt信号通路活性，并伴随着Caspase-3活性的增强[14]。而Xian YF等[15]、刘玲等[10]报道PI3K/Akt信号通路的激活可以拮抗Aβ诱导的PC12细胞凋亡。因此本研究进一步探讨阿立哌唑对Aβ25-35诱导的PC12细胞中PI3K/Akt信号通路激活情况，Bax、Bcl-2表达量及Caspase-3、Caspase-9活性的影响，结果表明，阿立哌唑能显著上调PI3K及Bcl-2表达，提高Akt磷酸化水平，降低Bax表达及Caspase-3、Caspase-9活性。这提示阿立哌唑可通过激活PI3K/Akt信号通路，调节信号通路下游凋亡相关蛋白表达或活性，进而改善Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤。

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（编辑：邹丽娟）

Effects of Aripiprazole on PC12 Cell Injury Induced by Aβ25-35and Its Mechanism

YANG Shuzhen，ZHAO Jingyuan（Dept.Seven of Psychiatry，the Second Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College，Henan Xinxiang 453002，China）

OBJECTIVE：To study the effects of aripiprazole on PC12 cell injury induced by amyloid β-protein（Aβ25-35）and its mechanism.METHODS：PC12 cells were randomized into normal control group，model group（20 μmol/L Aβ25-35），aripiprazole low-concentration，medium-concentration and high-concentration groups（5，10，20 μmol/L aripiprazole+20 μmol/L Aβ25-35）.These groups were cultured with culture medium containing relevant medicine for 48 h，with 6 wells in each group.The viability（optical density value）of PC12 cell was measured by MTT assay，and PC12 cell apoptosis was measured by Hoechst staining.The activities of Caspase-3 and Caspase-9 were determined by spectrophotometry.The protein expression of Bcl-2，Bax and PI3K and the phosphorylation of Akt were assayed by Western blot assay.RESULTS：Compared with normal control group，optical density value of model group was decreased while apoptotic rate was increased；the activities of Caspase-3 and Caspase-9，and the protein expression of Bax were increased；the protein expression of Bcl-2 and PI3K，the phosphorylation of Akt were decreased（P＜0.01）.Compared with model group，optical density value of aripiprazole low-concentration，medium-concentration and high-concentration groups were increased，while apoptotic rate and the activities of Caspase-3 and Caspase-9 were decreased；the protein expression of Bcl-2 and PI3K and the phosphorylation of Akt were enhanced；while the protein expression of Bax were decreased in aripiprazole medium-concentration and high-concentration groups（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS：Aripiprazole can suppress cell apoptosis of PC12 cell induced by Aβ25-35，which is related to activating PI3K/Akt signal pathway.

Aripiprazole；Amyloid β-protein；Nerve PC12 cell；Apoptosis；PI3K/Akt signal pathway

R361+.3

1001-0408（2017）01-0053-05

2016-04-23

2016-06-17）

＊主治医师，硕士。研究方向：神经病学。E-mail：jsprincess11@ 163.com

#通信作者：副主任医师，硕士。研究方向：精神病学。电话：0373-3373606

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.01.14