何 静，邱妍川，杨延音，林凤云，刘松青，江尚飞，朱照静#（1.重庆医药高等专科学校继续教育学院，重庆 4011；.重庆医药高等专科学校药学院，重庆 4011；.第三军医大学第一附属医院药剂科，重庆40008）

水飞蓟素肠溶聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒在大鼠在体肠灌流模型及Caco-2细胞模型中的吸收研究Δ

何 静1＊，邱妍川2，杨延音2，林凤云2，刘松青3，江尚飞2，朱照静2#（1.重庆医药高等专科学校继续教育学院，重庆 401331；2.重庆医药高等专科学校药学院，重庆 401331；3.第三军医大学第一附属医院药剂科，重庆400038）

目的：研究水飞蓟素肠溶聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒在大鼠在体肠灌流模型及结肠腺癌Caco-2细胞模型中的吸收特性。方法：采用高效液相色谱法测定水飞蓟素含量，考察水飞蓟素混悬液、水飞蓟素PLGA纳米粒和水飞蓟素肠溶PLGA纳米粒在大鼠在体肠灌流模型十二指肠、空肠、回肠和结肠的吸收速率常数（Ka）和表观吸收系数（Kapp）及其含低、中、高质量浓度（20、40、60 μg/mL）水飞蓟素时在Caco-2细胞模型中的表观渗透系数（Papp）。结果：与水飞蓟素混悬液比较，水飞蓟素PLGA纳米粒和水飞蓟素肠溶PLGA纳米粒在十二指肠、空肠、回肠和结肠的Ka、Kapp均增加（P＜0.05）；与对应浓度水飞蓟素混悬液比较，含低、中、高质量浓度水飞蓟素的肠溶PLGA纳米粒和PLGA纳米粒在Caco-2细胞模型中的双向Papp均增加（P＜0.05），其中水飞蓟素的肠溶PLGA纳米粒与PLGA纳米粒间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：水飞蓟素肠溶PLGA纳米粒可有效增加水飞蓟素肠内吸收及Caco-2细胞摄取和跨膜转运速率。

水飞蓟素；肠溶聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒；在体肠灌流模型；结肠腺癌Caco-2细胞；吸收

水飞蓟素（Silymarin）是从菊科植物水飞蓟中提取精制而成的一类具有抗肝炎病毒活性的黄酮类化合物的总称，临床上广泛用于急慢性病毒性肝炎、药源性肝损伤、肝硬化等多种肝脏疾病的治疗[1]。水飞蓟素主要由水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟宁和水飞蓟亭等组成，其中水飞蓟宾及其异构体异水飞蓟宾含量最高，约占该化合物的60%～70%，且具有最强的药理活性[2]。但是，由于水飞蓟素难溶于水，口服生物利用度很低，严重影响了其临床疗效的发挥和在临床的应用。已有研究显示，其大鼠口服给药后的绝对生物利用度约为0.95%[3]。

目前，市售水飞蓟素多为片剂或胶囊剂，患者用药剂量较大，需每天使用1.2～1.5 g。笔者前期采用纳米沉淀法以羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯（HPMCP）为肠溶材料、聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）为载体制备了水飞蓟素肠溶PLGA纳米粒和水飞蓟素PLGA纳米粒，结果显示，水飞蓟素肠溶PLGA纳米粒的稳定性较好，能有效抑制水飞蓟素在人工胃液中的释放[4]。本试验通过大鼠在体肠灌流模型及结肠腺癌Caco-2细胞模型，进一步评价其吸收特性。

1 材料

1.1 仪器

LC-2010C HT高效液相色谱仪（日本Shimdazu公司）；倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）；超速离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；MK3酶标仪（赛默飞世尔科技公司）；EVOM2上皮细胞电压电阻仪（美国WPI公司）；康宁3412Transwell系统（美国康宁公司）。

1.2 药品与试剂

水飞蓟素对照品（西安瑞林生物科技有限公司，批号：130802，纯度：＞98%）；水飞蓟素肠溶PLGA纳米粒和水飞蓟素PLGA纳米粒（重庆医药高等专科学校药剂学实验室自制，批号：均为20140801，含量：53.15 mg/g）；水飞蓟素片（商品名：益肝灵片，沈阳东陵药业股份有限公司，批号：130302，规格：每片38.5 mg）；0.25%胰蛋白酶（美国Amresco公司）；胎牛血清（FBS，美国Hyclone公司）；DMEM培养基、非必需氨基酸、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）、HBSS缓冲液（美国Gibco公司）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为去离子水。

1.3 细胞株与动物

Caco-2细胞株由美国组织培养中心提供。SD大鼠，♂，体质量为220～250 g，由重庆大学实验动物中心提供，合格证号为SCXK（渝）2014-0002。

2 方法与结果

2.1 水飞蓟素含量测定方法

2.1.1 色谱条件与专属性试验 色谱柱：Dikma-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.2%磷酸液（35∶65，V/V），流速：1 mL/min；检测波长：288 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL。该色谱条件下，取水飞蓟素对照品、结肠空白灌流液、空肠灌流液和给药30 min后细胞样品进样测定。水飞蓟宾和异水飞蓟宾的出峰时间分别为16.2、17.9 min，以两者峰面积之和进行水飞蓟素含量的计算，其他辅料不影响水飞蓟素的含量测定。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.1.2 肠灌流液中水飞蓟素的测定 精密称取水飞蓟素对照品10.2 mg，用甲醇超声溶解，用空白K-R缓冲液[5]稀释成质量浓度分别为0.102、0.204、0.51、2.04、10.2、20.4 μg/mL的系列溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤后，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以峰面积（y）为纵坐标、质量浓度（x）为横坐标进行回归分析，得回归方程为y＝332 578.6x+496.6（r＝0.999 8），水飞蓟素检测质量浓度的线性范围为0.102～20.4 μg/mL。取0.204、2.04、10.2 μg/mL的水飞蓟素系列溶液同日内进样5次，连续进样3 d考察日内、日间精密度，结果日内、日间RSD均小于2%。方法回收率为98.55%～100.26%（RSD＝4.15%，n＝3），37℃下2.5 h内稳定性试验的RSD＝5.68%（n＝5）。空白小肠段黏膜层与空白灌流液稀释所得的水飞蓟素系列溶液在37℃条件下孵育2 h后取样测定，RSD＝6.32%（n＝5）。

2.1.3 细胞样品中水飞蓟素的测定 取甲醇溶解的水飞蓟素溶液，用HBSS缓冲液稀释成质量浓度分别为0.102、0.204、0.51、2.04、10.2、20.4 μg/mL的系列溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以峰面积（y）为纵坐标、质量浓度（x）为横坐标进行回归分析，得回归方程为y＝456 635x+752.1（r＝0.999 9），水飞蓟素检测质量浓度的线性范围为0.102～20.4 μg/mL。取0.204、2.04、10.2 μg/mL的水飞蓟素系列溶液同日内进样5次，连续进样3 d考察日内、日间精密度。结果日内、日间RSD均小于2%，方法回收率为99.62%～100.22%（RSD＝3.45%，n＝3）。

2.2 大鼠在体肠灌流试验

SD大鼠禁食12 h后，以0.9%戊巴比妥钠麻醉并固定，照文献[5]报道的方法进行手术和药物灌流。各考察肠段（包括十二指肠、空肠、回肠、结肠）均取约10 cm进行试验，于试验结束后剪下试验肠段测量长度和半径。分别考察质量浓度为100 μg/mL的水飞蓟素肠溶PLGA纳米粒、水飞蓟素PLGA纳米粒、水飞蓟素混悬液（水飞蓟素片以去离子水重新分散）灌流后，水飞蓟素在不同肠段的吸收情况，采用质量法校正灌流液体积，计算3种样品在各肠段的吸收速率常数（Ka）和表观吸收系数（Kapp）。采用SPSS 20.0软件进行统计分析，两两比较采用方差分析。3种样品在大鼠在体肠灌流模型中Ka、Kapp的测定结果见表1。

表1 3种样品在大鼠在体肠灌流模型中Ka、Kapp的测定结果（±s，n＝6）Tab 1 Kaand Kappof 3 samples in rat in situ intestinesmodel（±s，n＝6）

表1 3种样品在大鼠在体肠灌流模型中Ka、Kapp的测定结果（±s，n＝6）Tab 1 Kaand Kappof 3 samples in rat in situ intestinesmodel（±s，n＝6）

注：与水飞蓟素混悬液比较，＊P＜0.05Note：vs.silymarin suspension，＊P＜0.05

参数Ka，×10－2L/s Kapp，×10－4cm/s水飞蓟素PLGA纳米粒5.37±1.62＊4.29±1.63＊3.59±1.54＊3.26±1.35＊14.08±5.98＊8.96±3.64＊8.21±3.59＊6.92±3.74＊肠段十二指肠空肠回肠结肠十二指肠空肠回肠结肠水飞蓟素混悬液1.68±0.82 1.22±0.65 0.98±0.44 0.67±0.32 5.25±1.69 2.68±1.09 2.31±1.22 1.65±1.03水飞蓟素肠溶PLGA纳米粒5.45±1.55＊4.33±1.48＊3.62±1.29＊3.58±1.22＊14.39±4.62＊10.28±2.57＊8.44±2.48＊6.58±2.52＊

由表1结果显示，与水飞蓟素混悬液比较，水飞蓟素肠溶PLGA纳米粒与水飞蓟素PLGA纳米粒在十二指肠、空肠、回肠和结肠的Ka、Kapp均增加（P＜0.05），但二者比较差异无统计学意义（P＞0.05）。可见，将水飞蓟素制备成为PLGA纳米粒后，可明显增加其在肠道的吸收。

2.3 Caco-2细胞模型双向转运试验

2.3.1 Caco-2细胞模型的建立 参考文献[6]进行Caco-2细胞培养，采用倒置显微镜观察细胞接种培养23 d后细胞单分子层的形态。结果显示，细胞呈紧密单层，边界清晰，并且在细胞间形成了良好的紧密连接，细胞跨膜电阻＞600 Ω/cm2。采用普萘洛尔转运试验[7]测得细胞的表观渗透系数（Papp）为（28.57±0.25）×10－6cm/s，表明本试验建立的Caco-2细胞模型有紧密的细胞单分子层，具有较好的完整性和渗透性，满足试验需要。Caco-2细胞形态图见图2。

图2 Caco-2细胞形态图（×400）Fig 2 Caco-2 cellular morphology（×400）

2.3.2 质量浓度的选择 采用MTT法测定水飞蓟素对Caco-2细胞的毒性，结果显示，水飞蓟素质量浓度在20～100 μg/mL范围内其吸光度无突然下降的现象，表明在该范围内给药对Caco-2细胞无毒性。本试验选择水飞蓟素质量浓度为20、40、60 μg/mL的水飞蓟素肠溶PLGA纳米粒、水飞蓟素PLGA纳米粒、水飞蓟素混悬液进行试验。

2.3.3 双向转运试验 取水飞蓟素肠溶PLGA纳米粒、水飞蓟素PLGA纳米粒和水飞蓟素片粉末，以HBSS缓冲液分散稀释，分别制备成低、中、高质量浓度（20、40、60 μg/mL）的供试液。在肠腔侧（AP）→基底侧（BL）的转运试验中，于AP侧加入供试液0.5 mL，BL侧加入HBSS缓冲液1.5 mL；BL→AP的转运试验中，于BL侧加入供试液1.5 mL，AP侧加入HBSS缓冲液0.5 mL。37℃条件下振摇孵育，分别于10、20、30、45、60、90、120 min吸取接收液0.1 mL测定，同时加入等量HBSS缓冲液于Transwell板中，试验完成后，测定跨膜电阻以保证细胞膜完整性。计算3种样品在Caco-2细胞中的累积吸收量（AP→BL）、累积分泌量（BL→AP）和Papp，以Papp（BL→AP）与Papp（AP→BL）的比值计算外排比率（ER），结果见表2。

表2 不同质量浓度的3种样品在Caco-2细胞中累积吸收量、分泌量、Papp和ER的测定结果（±s，n＝3）Tab 2 Accumulative absorption volume，secretory volume，Pappand ER of different concentrations of 3 samples in Caco-2 cell（±s，n＝3）

表2 不同质量浓度的3种样品在Caco-2细胞中累积吸收量、分泌量、Papp和ER的测定结果（±s，n＝3）Tab 2 Accumulative absorption volume，secretory volume，Pappand ER of different concentrations of 3 samples in Caco-2 cell（±s，n＝3）

注：与同质量浓度的水飞蓟素混悬液比较，＊P＜0.05Note：vs.silymarin suspension with corresponding concentration，＊P＜0.05

ER 1.02 1.04 1.04 1.02 0.97 1.06 0.96 0.92 1.01样品水飞蓟素肠溶PLGA纳米粒水飞蓟素PLGA纳米粒水飞蓟素混悬液质量浓度，μg/mL 20 40 60 20 40 60 20 40 60累积吸收量，μg 4.85±0.08＊9.58±0.25＊14.57±0.59＊4.33±0.11＊9.85±0.45＊14.03±1.33＊1.33±0.03 2.89±0.56 4.08±1.03累积分泌量，μg 5.22±0.09＊10.33±0.21＊14.85±1.28＊4.52±0.18＊9.03±0.84＊4.22±1.56＊1.26±0.05 2.69±0.84 4.21±0.99 Papp，×10－6cm/s BL→AP 9.64±0.58＊9.52±0.69＊9.31±0.78＊9.22±0.64＊9.46±0.89＊9.04±1.06＊3.22±0.15 3.65±0.11 3.59±0.18 AP→BL 9.86±0.76＊9.88±0.48＊9.67±0.62＊9.45±0.47＊9.15±1.08＊9.62±1.57＊3.09±0.18 3.35±0.21 3.63±0.25

由表2可知，与同质量浓度水飞蓟素混悬液比较，含低、中、高质量浓度水飞蓟素的肠溶PLGA纳米粒和PLGA纳米粒在Caco-2细胞模型中的双向Papp均增加（P＜0.05），其中水飞蓟素的肠溶PLGA纳米粒与PLGA纳米粒间差异无统计学意义（P＞0.05）。可见，将水飞蓟素制备成为PLGA纳米粒后，可明显增加其细胞转运的Papp。

3 讨论

水飞蓟素作为肝疾病的辅助用药广泛应用于临床，其不仅可有效保护肝细胞，拮抗肝纤维化，近年来越来越多的研究显示其还具有除肝保护作用以外的药理效应，在抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗炎等方面都具有良好的研发和临床应用前景[8-10]，故进一步开发稳定性好、毒性小、制备工艺简单的新型水飞蓟素给药系统具有很好的临床实用价值[11-12]。

从本试验所得的Kapp与Papp均可以看出，将水飞蓟素制备为PLGA纳米粒之后，可显著改善其体内的溶解性和渗透性，有利于增加其口服给药的生物利用度。此外，本研究还对不同剂量水飞蓟素制剂在Caco-2细胞模型中的双向转运进行考察，结果显示，其双向转运可能与剂量无关，提示水飞蓟素在体内主要以被动扩散为主进行吸收，且ER均接近1，表明其吸收过程可能不受外排转运蛋白的影响，但具体情况需进一步研究确定[13-14]。

PLGA是目前开发最为成功的一种生物可降解聚合物，具有较好的生物相容性，可用于多种药物制剂的处方，包括亲水性、疏水性药物，也包括各种大分子或小分子药物，可有效延缓药物在体内的释放，降低药物在体内的代谢速度以及实现药物的靶向给药[15-16]。从本研究结果看，将水飞蓟素制备为肠溶PLGA纳米粒或PLGA纳米粒后，可有效改善其吸收特征。与水飞蓟素PLGA纳米粒比较，预计水飞蓟素肠溶PLGA纳米粒可减小水飞蓟素对胃部的刺激，降低其胃部不良反应的发生次数和程度。

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Study on the Absorption of Silymarin Enteric Coated-PLGA Nanoparticles in Rat in situ Intestine Perfusion Model and Caco-2 Cell Model

HE Jing1，QIU Yanchuan2，YANG Yanyin2，LIN Fengyun2，LIU Songqing3，JIANG Shangfei2，ZHU Zhaojing2（1.College of Extended Education，Chongqing Medical and Pharmaceutical College，Chongqing 401331，China；2.College of Pharmacy，Chongqing Medical and Pharmaceutical College，Chongqing 401331，China；3.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital to Third Military Medical University，Chongqing 400038，China）

OBJECTIVE：To study the absorption features of Silymarin enteric coated-polyllactic-co-glycolic acid（PLGA）nanoparticles in rat in situ intestine perfusion model and colonic adenoma Caco-2 cell model.METHODS：HPLC method was used to determine the content of silymarin.The absorption rate constant（Ka）and apparent absorption coefficient（Kapp）of Silymarin suspension，Silymarin PLGA nanoparticles and Silymarin enteric coated-PLGA nanoparticles were investigated in duodenum，jejunum，ileum and colon of rat in situ intestine perfusion model；the apparent permeability coefficient（Papp）of those drugs containing low-concentration，medium-concentration and high-concentration（20，40，60 μg/mL）of silymarin in Caco-2 cell model were also investigated.RESULTS：Compared with Silymarin suspension，Kaand Kappof Silymarin PLGA nanoparticles and Silymarin enteric coated-PLGA nanoparticles were all increased in duodenum，jejunum，ileum and colon（P＜0.05）；compared with the corresponding concentration Silymarin suspension，two-way Pappof Silymarin PLGA nanoparticles and Silymarin enteric coated-PLGA nanoparticles containing low-concentration，medium-concentration and high-concentration of silymarin were all increased in Caco-2 cell model（P＜0.05）；there was no statistical significance between Silymarin PLGA nanoparticles and Silymarin enteric coated-PLGA nanoparticles（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Silymarin enteric coated-PLGA nanoparticles can effectively increase the intestinal absorption，cellular uptake and transmembrane transport rate of silymarin.

Silymarin；Enteric coated-PLGA nanoparticle；in situ intestine perfusion model；Colonic adenoma Caco-2 cell；Absorption

R965

A

1001-0408（2017）01-0046-04

2016-04-05

2016-06-22）

（编辑：邹丽娟）

重庆市科技攻关计划项目（No.cstc2012ggyyjs10008）；重庆市医学科研计划项目（No.2012-2-256）

＊副教授，硕士。研究方向：缓控释制剂。电话：023-61969212。E-mail：hejingt@126.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：制剂研究。电话：023-61969994。E-mail：zhaojing6271@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.01.12