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牦牛和雄性不育犏牛睾丸中Prm1和Prm2基因表达

2017-02-15王鹏非黄林唐会会金素钰郑玉才

湖北农业科学 2016年20期
关键词:牦牛睾丸

王鹏非+黄林+唐会会+金素钰+郑玉才

摘要:为探索牦牛(Bos grunniens)杂交后代(犏牛)雄性不育的分子机制,比较了牦牛及其杂交后代睾丸中两种精蛋白(Prm)基因的表达。从成年牦牛(n=13)和犏牛(n=7)睾丸中提取总RNA,定量PCR分析表明,犏牛睾丸中Prm1和Prm2基因的mRNA水平均极显著低于牦牛(P<0.01),这将影响正常精子发生的过程,推测可能与犏牛雄性不育有一定关系。

关键词:牦牛(Bos grunniens);杂交雄性不育;睾丸;Prm1;Prm2

中图分类号:S823.8+5 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2016)20-5375-03

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.053

Abstract: To elucidate the molecular mechanism of hybrid male sterility of yak, the expressions of two protamines (Prm) between yak and its hybrid (cattle-yak) was compared. Total RNA was extracted from the testes of yaks (n=13) and cattle-yaks(n=7),and quantative PCR analysis showed that the testicular Prm1 and Prm2 mRNA levels in cattle-yaks were significantly lower than those of yaks(P<0.01),which may affect normal spermatogenesis, and thus we speculate that the significantly reduced mRNA levels of the two gene might associate with the male sterility of cattle-yak.

Key words: yak(Bos grunniens); hybrid male sterility; testis; Prm1; Prm2

牦牛(Bos grunniens)是适应青藏高原低氧环境的特有牛种。牦牛与普通牛的杂交后代(称犏牛)在产乳、产肉等方面具有明显的杂种优势,但表现为回交三代内雄性不育[1],而雌性杂交后代生殖正常,其分子机制一直未阐明。研究表明,很多基因在犏牛睾丸中的mRNA水平都低于其亲本牦牛和黄牛,如SYCP3、Boule、Dazl、Dmc1等基因[2-4]。牦牛和犏牛睾丸蛋白质组学研究也发现,与牦牛相比,犏牛睾丸中大多数蛋白质表达下调[5]。

精蛋白(Protamine)是在精子細胞形成后期合成的,富含精氨酸,是主要的精子核蛋白,能结合DNA并使精子细胞基因组浓缩为非活性状态[6]。哺乳动物中包括精蛋白1(P1)和精蛋白2(P2)家族研究的最多,分别由Prm1和Prm2基因编码,前者存在于所有哺乳动物中,包装精子DNA;而Prm2仅存在于灵长类、多数啮齿类和其他胎盘哺乳类亚类中,是精子发挥功能所必需的[6]。人类精子中Prm1与Prm2基因的表达水平相近,二者比例的升高或降低均可能与男性不育关联[7]。本研究对成年牦牛和雄性不育犏牛睾丸中Prm1和Prm2基因mRNA水平进行定量PCR检测,以探索其与犏牛雄性不育之间的关系。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

选择健康的成年麦洼牦牛13头和成年雄性不育犏牛7头(公黄牛与母麦洼牦牛的杂交后代),于秋季屠宰时迅速采集睾丸,纵切面剖开成若干小块后用干冰带回实验室,-80 ℃保存备用。

1.2 试剂与仪器

试剂:Trizol Reagent购自美国Ambion公司;RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购自美国Thermo Scientific公司;QuantiFast SYBR Green PCR Kit购自德国QIAGEN公司。

仪器:C1000 Thermal Cycler梯度PCR仪、C1000 Touch Thermal Cycler荧光定量PCR仪、Versa Doc 1000凝胶成像系统均为美国Bio-Rad公司产品。

1.3 睾丸总RNA的提取及反转录

按照试剂盒说明书用Trizol法提取牦牛和犏牛睾丸总RNA,经核酸蛋白检测仪和琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度和质量。用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit以2 μg总RNA为模板,利用随机引物进行反转录得到cDNA备用。

1.4 睾丸Prm1和Prm2基因的定量分析

以普通牛Prm1(NM_174156)、Prm2(NM_174157)和普通牛内参基因GAPDH (NM_001034034)、18s RNA(NR_036642)为模板,设计定量PCR引物(表1)。对2个目的基因和2个内参基因进行PCR扩增,产物纯化后经10倍梯度稀释作为模板,进行实时荧光定量PCR扩增,并用定量PCR仪上的软件绘制标准曲线。

以反转录的牦牛和犏牛睾丸cDNA为模板,采用荧光定量PCR方法分析Prm1基因和Prm2基因的相对表达量。25 μL的荧光定量PCR体系包括:2×Quanti Fast SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL、上、下游引物各1 μL、模板cDNA 1 μL、RNase-free water 9.5 μL。PCR条件:95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性15 s,64 ℃退火15 s,72 ℃延伸15 s,共40个循环;65 ℃~95 ℃制作融解曲线。

1.5 数据统计

采用2-△△Ct法计算Prm1和Prm2基因在睾丸中的相对表达水平[8]。用双内参GAPDH和18sRNA的几何平均数进行标准化,以牦牛睾丸的表达量为对照。试验数据用平均值±标准误表示,用SPSS18.0软件对荧光定量数据进行t检验。

2 结果与分析

2.1 检测Prm1和Prm2 mRNA水平的荧光定量PCR方法建立

本试验提取的牦牛和犏牛睾丸RNA质量经核酸蛋白检测仪和琼脂糖凝胶电泳分析,質量均符合要求。试验建立了分析牦牛和犏牛Prm1和Prm2基因mRNA相对水平的定量PCR方法,并采用双内参基因的几何平均数进行标准化。目的基因和内参基因扩增特异性高(图1),扩增效率为93.7%~95.1%,标准曲线线性关系较好(R2>0.99),符合定量要求。

2.2 牦牛和犏牛睾丸中Prm1和Prm2基因mRNA相对表达量的比较

对成年牦牛和雄性不育犏牛睾丸中Prm1和Prm2基因mRNA水平的荧光定量PCR分析结果表明,犏牛睾丸中Prm1和Prm2基因mRNA水平均极显著低于牦牛(P<0.01),两个基因在犏牛睾丸中均仅有微弱的表达(图2)。

3 讨论

犏牛的杂种优势在生产实际中具有重要的价值,但其雄性不育制约了犏牛的有效利用。很多研究证实犏牛睾丸和附睾中无精子[1,9]。犏牛精子发生受阻很可能与减数分裂异常有关。已有研究表明,犏牛睾丸中很多基因的表达下调[2-5],但这与其雄性不育的因果关系仍不清楚。Prm1和Prm2基因在人睾丸中仅表达于圆形和长形精子细胞中,而不存在于精原细胞、精母细胞和Sertoli等细胞中[10]。有报道表明,人Prm1和Prm2基因存在单核苷酸多态性,与男性不育存在一定关系,且研究结果提示减数分裂前期停滞可能导致精蛋白表达的大幅度下降[11]。犏牛雄性不育很可能与减数分裂异常有关,其睾丸中极低水平的Prm1和Prm2表达可能与此有类似的机制。另外,犏牛睾丸中的细胞组成明显不同于成年牦牛[9],根据Prm1和Prm2基因在人睾丸细胞中的表达特征[10],其Prm1和Prm2表达水平也会显著下降。

在人类中精蛋白基因突变、表达异常与男性不育存在显著的关联[12]。精蛋白基因进化快,牦牛Prm1和Prm2基因序列及表达调控需要进一步研究,以全面阐明犏牛精子发生障碍的详细分子生物学机制。

参考文献:

[1] 张旭静.牦牛和普通牛种间杂种公牛睾丸的组织学观测与研究[J].畜牧兽医学报,2001,32(4):314-318.

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[3] 付 永,魏雅萍,吴克选,等.Real-time PCR检测黄牛、牦牛、犏牛睾丸组织中Boule、Dazl基因mRNA表达[J].生物技术通报,2012(10):150-155.

[4] 李 贤,李齐发,赵兴波,等.牦牛和犏牛Dmc1基因序列分析及睾丸组织转录水平研究[J].中国农业科学,2010,43(15):3221-3229.

[5] 付 伟,李彩霞,刘文静,等.利用双向电泳-质谱技术鉴定牦牛和犏牛睾丸中的差异表达蛋白质[J].西南民族大学学报(自然科学版),2014,40(1):11-15.

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