张卓睿+高辉+葛冬雪+姜贵全

摘要：以地榆（Sanguisorba officinalis L.）根为材料，对其所含黄酮类物质进行了提取工艺研究。通过单因素试验考察了乙醇体积分数、原料粒度、液料比、超声功率、超声时间、超声次数对地榆总黄酮提取率的影响，在单因素基础上，利用响应面法设计，优化了各项工艺参数。结果表明，超声提取地榆根总黄酮的最佳工艺条件为乙醇体积分数47.78%、原料粒度40～60目、液料比20∶1（mL∶g）、超声功率374.25 W、超声时间33.70 min。此工艺条件下，地榆根中总黄酮提取率为10.565%。按照响应面优化的最佳提取工艺条件，对40～60目地榆粉末超声提取3次，测量总黄酮提取率为11.035%。研究结果表明，超声辅助提取的黄酮得率要高于一些传统方法，适合对地榆总黄酮进行提取加工。

关键词：地榆（Sanguisorba officinalis L.）根；总黄酮；超声提取；响应面法

中图分类号：TS209；S567.23+9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）20-5340-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.043

Abstract： Using Sanguisorba officinalis root as material，the extraction technology of total flavonoids from it was studied. Through single factors experiment，the effects of ethanol volume fraction， particle size，solvent-to-solid ratio，ultrasonic power，ultrasonic time，and ultrasonic frequency on the extraction rate of total flavonoids from Sanguisorba officinalis root were investigated，and then the process parameters had been optimized by the response surface design. The results showed that the optimum extraction conditions were ethanol volume fraction of 47.78%，material particle size of 40～60 mesh，solvent-to-solid ratio of 20∶1（mL∶g）， ultrasonic power of 374.25 W，ultrasonic time of 33.70 min. Under these conditions，the extraction rate of total flavonoids from Sanguisorba officinalis root was 10.565%. According to the optimum conditions，40～60 mesh powders of Sanguisorba officinalis root were extracted by ultrasonic extraction for 3 times，and the measured extraction rate of total flavonoids was 11.035%. It could be concluded that the ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from Sanguisorba officinalis root was higher than some traditional methods，which was suitable for the extraction process of flavonoids from Sanguisorba officinalis L..

Key words： Sanguisorba officinalis L. root； total flavonoids； ultrasonic extraction； response surface methodology

地榆（Sanguisorba officinalis L.）為蔷薇科（Rosaceae）地榆属植物的根及根状茎，广泛分布于欧洲和亚洲北温带，在中国主要分布于东北、华北、西北、华东、中南及广西等地区[1]。地榆是一种常用中药，具有凉血止血，解毒敛疮之功效，临床上可用于便血、痔血、血痢、崩漏、水火烫伤及痈肿疮毒的治疗[2]。现代研究表明，地榆中含有鞣质[3]、三萜皂苷[4]、黄酮、蒽醌、甾体类[5]等多种化学成分，具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、治疗心血管疾病等功效[6，7]，是极具开发价值的野生植物资源。黄酮类物质是一大类天然多酚化合物，可防治心脑血管疾病和呼吸系统疾病，具有抗炎抑菌、降血糖、抗氧化、抗辐射、抗癌、抗肿瘤以及增强免疫能力等生理活性[8-10]。黄酮的提取方法主要有热回流提取、酶提取、微波辅助提取和超声辅助提取等[11]。其中超声波辅助提取是利用超声波产生的“空穴作用”破碎植物细胞，使提取液不断振荡，有利于黄酮类化合物的溶出和扩散，大大提高了植物有效成分的提取率[12]。目前关于地榆黄酮的提取鲜有报道，且方法也仅限于一些传统提取工艺，而有关超声波辅助提取至今尚无相关报道，故本试验采用超声波辅助提取地榆总黄酮，以期为今后开展地榆的研究工作提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试材料为地榆，2013年9月采于吉林市二道林场，洗净、干燥、粉碎后，密封避光保存；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等试剂均为分析纯（南京化学试剂有限公司）；芦丁为生化试剂（美国Sigma公司）。

1.2 仪器与设备

TU1810型紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；LG10-2.4A型高速离心机（北京医用离心机厂）；WK-1000A型高速藥物粉碎机（青州市精诚机械有限公司）；JY92-2D型超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；RE-85Z型旋转薄膜蒸发器（上海青浦泸西仪器厂）；QUANTA200型环境扫描电子显微镜（荷兰FEI公司）。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制 精密量取质量浓度0.2 mg/mL芦丁标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于6只10 mL比色管中，各加30%乙醇至5 mL，精密加入5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，再各加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，加1 mol/L NaOH溶液4 mL，并分别加水定容至10 mL，摇匀，放置15 min。以空白试剂为参比液，在510 nm下测定吸光度[13]。以吸光度A为纵坐标，标准溶液质量浓度为横坐标绘制标准曲线，用最小二乘法进行回归，得吸光度A与总黄酮浓度x线性方程为：A=11.675x+0.033 5，R2=0.997 8，表明总黄酮浓度在0.02～0.10 mg/mL范围内与吸光度呈较好的线性关系。

1.3.2 地榆中总黄酮的提取 准确称取2.0 g地榆粉置于100 mL烧杯中，按最佳料液比加入一定体积分数的乙醇，超声波辅助提取一定时间后，提取液用8 000 r/min离心10 min，上清液于100 mL容量瓶中定容。

1.3.3 样品中总黄酮含量的测定 取1 mL定容后提取液，按“1.3.1”方法测定吸光度A，由标准曲线回归方程得出样品溶液中总黄酮的质量浓度C，再计算出样品中总黄酮的提取率。计算公式为：

式中，D为样品溶液稀释倍数；C为样品溶液中总黄酮质量浓度，mg/mL；V1为测定时比色管中溶液体积，mL；V2为样品溶液总体积，mL；m为样品质量，mg。

1.3.4 单因素试验 以总黄酮提取率为检测指标，分别考察提取方法、乙醇体积分数、超声功率、原料粒度、液料比（mL∶g，下同）、超声时间、超声次数7个因素对地榆中总黄酮提取率的影响。

1.3.5 Box-Behnken试验设计 在单因素试验的基础上，利用Design-expert软件进行Box-Behnken试验设计，优化地榆总黄酮的提取工艺条件，试验因素与水平见表1。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取方法对地榆中总黄酮提取率的影响 不同提取方法对地榆中总黄酮提取率的影响见表2。由表2可以看出，酶-超声辅助提取法的提取率最高，超声提取法次之，不过两者差别并不显著，而酶提取法和回流提取法的提取率皆较低。将酶-超声辅助提取法和超声提取法提取前后的地榆物料在室温条件下风干，置于载物台上用离子溅射仪喷金后在扫描电子显微镜下观察其形貌变化，如图1所示。从图1（a）可以看出，未经提取原料内部结构完整密实，提取后则呈现出疏松多孔结构，这是由于超声波的空化作用引起提取溶液体系的宏观湍动和固体颗粒的高速碰撞，导致传质边界层变薄、植物组织细胞破壁或变形，而这有利于溶剂更充分地渗透到植物细胞中，溶出其中化学成分。对比图1（b）和图1（c），可以发现两种提取方法处理后，地榆内部松散程度大体相同，因此，两者的提取率相近，但酶-超声辅助提取法引入了外来酶，增加了成本，且不利于后期分离纯化，综合考虑，本试验选择超声提取法从地榆中提取总黄酮。

2.1.2 提取参数对地榆中总黄酮提取率的影响 乙醇体积分数对地榆总黄酮提取率的影响如图2（a）所示。从图2（a）可以看出，随着乙醇体积分数的升高，总黄酮提取率先升高后降低，在乙醇体积分数为50%时达到最大值，这主要是因为该体积分数的乙醇可以使醇溶性和水溶性黄酮类物质都能最大程度地溶出。因此，确定地榆黄酮提取时较佳的乙醇体积分数为50%。

超声功率对地榆总黄酮提取率的影响如图2（b）所示。由图2（b）可见，随着超声功率的增加，植物组织被破坏程度逐渐加大，提取率逐渐升高，当超声功率为360 W时提取率达到最大值，之后再继续增大功率，超声波产生的热效应使部分黄酮发生氧化，导致总黄酮提取率开始下降。因此，确定较佳的提取超声功率为360 W。

液料比对地榆总黄酮提取率的影响如图2（c）所示。从图2（c）可以看出，随着液料比的增加，总黄酮提取率逐渐增大，当液料比为20∶1时提取率达到最大值；之后再继续增加溶剂，体系内过多的溶液会增大超声破碎细胞的阻力，使细胞破碎不完全，进而影响了黄酮类物质的溶出。因此，确定较佳的提取液料比为20∶1。

不同原料粒度对总黄酮提取率的影响如图2（d）所示。由图2（d）可见，40～60目原料提取率最高，因为原料粒度越小，比表面积越大，溶剂与之接触越充分，从而有利于总黄酮的浸出，但如原料粒度过小，杂质大量溶出会阻碍黄酮物质的溶出，且也不便于提取液的后期处理。因此，确定较佳的原料目数为40～60目。

超声时间对地榆总黄酮提取率的影响如图2（e）所示。超声提取时间越长，黄酮类物质浸出越充分，但如果时间过长，空化作用产生的热效应又会使黄酮氧化分解。从图2（e）可以看出，超声时间超过30 min以后，总黄酮提取率无明显升高，反而有下降趋势。因此，确定比较适宜的超声时间为30 min。

超声次数对地榆中总黄酮提取率的影响如图2（f）所示。由图2（f）可见，当超声提取3次后，提取率已无显著提高，说明经3次超声处理，地榆所含黄酮类物质已大部分溶出，因此，确定适宜的提取次数为3次。

2.2 Box-Behnken试验结果

Box-Behnken试验结果见表3。利用Design-Expert 7.0.0软件对试验结果进行多元回归拟合，以地榆总黄酮提取率为响应值，得到提取率与所选4个因素的二次多项回归方程为：

Y=10.59+0.044A-0.29B+0.32C+0.18D-0.13AB-0.19AC+0.12AD+0.058BC+0.30BD+0.29CD-0.49A2-0.50B2-0.47C2-0.62D2

通过比较一次项系数绝对值大小，可知影响地榆中总黄酮提取率主次因素为：提取时间>乙醇体积分数>超声功率>液料比。对表3数据进行方差分析，结果见表4。由表4可知，回归模型检验的P<0.000 1，表明试验所采用的二次模型回归效果极显著，具有统计学意义，而失拟项检验的P=0.343>0.05，表现为不显著，证明无失拟因素存在，未知因素对试验结果干扰小，可用回归方程对试验结果进行分析。综上所述，该回归方程是地榆总黄酮提取率与主要提取参数间较合适的数学模型，利用此方程可确定地榆总黄酮的最佳提取工艺参数。由表4还可以看出，各交互作用中，乙醇体积分数与超声功率、超声时间与超声功率的交互作用对响应值影响极显著，其三维响应曲面见图3。由图3可以看出，乙醇体积分数与超声功率、超声时间与超声功率交互作用的等高线皆为椭圆形，说明这两种交互效应较强，对地榆总黄酮的提取率影响比较显著，且在所选范围内都存在极值点，极值点所对应的条件位于等高线中心点处。图3（a）表示乙醇体积分数和超声功率对总黄酮提取的影响，乙醇体积分数曲面斜率大于超声功率曲面斜率，说明乙醇体积分數对地榆中总黄酮提取率的影响大于超声功率；图3（b）表示超声时间和超声功率对总黄酮提取率的影响，可以看出随着超声时间与超声功率的增加，曲面变化都很陡峭，但沿提取时间轴向等高线变化密集，说明提取时间对地榆总黄酮提取率的影响大于超声功率。

通过响应面法得出的最佳提取工艺条件为液料比20∶1，乙醇体积分数47.78%，超声时间33.70 min，超声功率374.25 W。按此条件进行3次验证试验，得总黄酮平均提取率为10.565%，实际值与预测值（10.702%）基本吻合。按照最佳提取工艺条件，对40～60目地榆粉末超声提取3次，测量总黄酮提取率为11.035%。

3 结论

研究结果表明，回流提取法、酶提取法、酶-超声辅助提取法、超声提取法4种方法中，超声提取法的提取效果较好，提取效率较高，比较分析后选择该方法提取地榆总黄酮；在单因素试验的基础上进行响应面试验优化提取工艺，确定地榆根总黄酮的最佳提取工艺条件为原料粒度40～60目、液料比20∶1、乙醇体积分数47.78%、超声功率374.25 W、超声时间33.70 min。在此工艺条件下，地榆根中总黄酮提取率为10.565%；按照最佳工艺条件超声提取地榆粉3次，所得提取液总黄酮提取率为11.035%。综合研究结果，可以得出地榆总黄酮适于采用超声波法提取，提取时间短，提取率较高。

黄酮类化合物可防治心脑血管系统和呼吸系统疾病，有降血糖、抗氧化、抗癌、增强免疫能力等功效，具有良好的开发前景和研究意义。通过研究所确定的超声辅助提取最佳工艺条件，可为地榆黄酮的进一步深入研究及产品开发提供良好的技术支撑和研究基础。

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