邢艳丽,高 潇△,张 立,樊宇婷，夏 梦，卜亚龙

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001； 2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

调制中频脉冲电刺激SUI大鼠会阴穴对盆底组织LOX的影响及治疗机制的研究*

邢艳丽1,高 潇1△,张 立1,樊宇婷2，夏 梦2，卜亚龙2

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001； 2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：应用调制中频脉冲电刺激压力性尿失禁(SUI)大鼠会阴穴，观察其对盆底组织中赖氨酰氧化酶(LOX)的影响及治疗机制的研究。方法：采用阴道扩张压迫、摘除双侧卵巢术制备SUI大鼠模型。将80只雌性SD大鼠，随机分为空白组、模型组、电针组和中频组，每组20只。各组大鼠在治疗前及治疗第7天、第14天随机选取10只大鼠进行最大膀胱容量测定(MBC)，并处死取材，应用酶联免疫法观察耻骨肌中LOX的表达及尿道下阴道壁、耻骨尿道韧带和尿道周围结蹄组织Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量以及Ⅰ/Ⅲ比值的变化。结果：与模型组相比中频组、电针组的MBC、耻骨肌中LOX的含量、盆底支持组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量以及Ⅰ/Ⅲ比值较模型组均明显提高(P<0.05)，且中频组优于电针组(P<0.05)。 结论：中频脉冲电刺激会阴穴能有效的增大SUI大鼠的MBC，改善临床症状；中频脉冲电刺激会阴穴能有效促进耻骨肌中LOX的表达，进而增加盆底结蹄组织的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量以及Ⅰ/Ⅲ比值。

压力性尿失禁；会阴穴；脉冲调制中频电疗法；赖氨酰氧化酶；胶原蛋白

压力性尿失禁(Stress urinary incontinence，SUI)是妇产科常见病，是指在腹压增加时(如咳嗽、喷嚏、大笑、提重物或体位改变等)引起的不自主尿液漏出。大量的调查报告显示SUI的发病率约15%～65%，多发生于老年人，其中45～49岁年龄段的妇女达到高峰即65%[1]。而且许多患者对本病认识不足或由于害羞而难于启齿，大约只有1.5%～6%的女性尿失禁患者寻求正确的治疗[2]。胶原作为具有抗拉伸作用的盆底支持组织，在控尿方面起重要作用，其含量、强度和网状排列是维持其功能的重要影响因素，而赖氨酰氧化酶(Lysyl oxidase,LOX)是胶原和弹性纤维交联的关键酶，它能够促进其发育成熟，维持内环境的稳态，其活性下降会导致蛋白交联强度下降，使盆底结构出现生物力学改变。人体组织是由大量的水分、无机盐以及各种带电胶体组成的电解质导体，脉冲调制中频电治疗仪将低频正弦调制的具有快速最大功能性电刺激中频脉冲电流导入人体产生刺激，使作用部位的离子浓度和分布发生显著变化，从而影响人体组织功能[3]。本研究旨在通过应用调制中频脉冲电刺激SUI大鼠会阴穴，来观察此法对SUI大鼠盆底组织LOX，Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量以及Ⅰ/Ⅲ比值的影响，探讨该法治疗压力性尿失禁的有效性及治疗机制，为临床推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

选用12周龄SPF级健康SD大鼠80只(由黑龙江中医药大学动物实验中心提供)，体质量(280±20)g。采用随机数字法将大鼠分为空白组、模型组、电针组及中频组，每组20只。

1.2 动物造模

1.2.1 模型制备 本实验模拟产程延长加绝经后压力性尿失禁大鼠模型。大鼠适应性喂养1周后进入实验。将大鼠麻醉，仰卧位固定后排空膀胱，把F8球导管前端修剪光滑，插入大鼠阴道3 cm左右，注水扩张阴道，并对阴道口“8”字缝合，再将大鼠俯卧位固定，耻骨联合与桌沿相切，导管下端悬挂100 g重物，持续压迫6 h后撤除。阴道压迫1周后行双侧卵巢摘除术：从大鼠背部正中做一约3 cm纵形切口，剪开背部皮肤，找到包裹在脂肪内的粉色卵巢，结扎卵巢血管，并摘除卵巢，将组织送回腹腔内缝合肌肉。

1.2.2 检测模型是否成功 ①最大膀胱容量(MBC)测定:大鼠麻醉后仰卧位固定。将涂有液态石蜡的留置针前端透明套管经尿道插入膀胱内，见黄色尿液排出证实导管位于膀胱内，排空膀胱。用无菌生理盐水注满留置针延长管并排空管内空气，其白色帽端的接口与20 ml无菌注射器相连，用注射器以36 ml/h的速度向膀胱注入蓝色的美兰溶液，以尿道口溢出第一滴蓝色液体所注入的美兰体积为最大膀胱容量。②喷嚏实验:先排空大鼠膀胱，向膀胱注入混有美兰的生理盐水，注入量为所测得MBC的一半，剪一段鼠须刺激大鼠鼻孔至其打喷嚏，观察尿道口是否有蓝色液体流出，如有则造模成功。

1.3 主要试剂与仪器

多功能酶标仪(瑞士TECAN M200 PRO)；MTZ-M多功能脉冲调制中频(北京御健康复医疗仪器有限公司)；长城牌KWD-808I脉冲电疗仪(江苏武进医疗器械厂)；0.35×50 mm华佗牌针灸针(苏州医疗用品厂)；极片(购置于哈尔滨昌泰大药房)。

1.4 治疗方法

空白组与模型组大鼠置于普通笼中饲养，均不予任何治疗。中频组大鼠采用多功能脉冲调制中频电疗机(MTZ-M型)治疗，将改良极片的负极贴于大鼠会阴穴、正极贴于中极穴。启动开关，设置处方输出为2 Hz，刺激量以大鼠耐受为宜(大鼠不产生挣扎)，每日1次，每次治疗20 min，持续治疗14天。电针组大鼠治疗方案参照全国中医药行业高等教育“十二五”规划教材(第9版)的《针灸治疗学》中治疗尿失禁的处方针刺，取曲骨穴、关元穴、膀胱俞、肾俞、三阴交，曲骨穴与关元穴接电针，用疏密波刺激20 min，每日1次，持续治疗14天。

1.5 取材、检测指标及方法

最大膀胱容量测定方法同前。

1.5.1 取材 在治疗前、治疗第7天、第14天结束后，从各组中随机各选取10只大鼠进行MBC测定,测定后处死大鼠，取耻骨联合和尾骨之间走形的耻骨肌和尿道下阴道壁、耻骨尿道韧带和尿道周围结缔组织为标本，标本用生理盐水冲洗干净后，用液氮研磨碎、裂解液裂解，匀浆处理后冰上孵育30 min，不时用枪头吹打匀浆液，确保组织与裂解液充分接触，裂解后离心，取上清液，置于-80℃冰箱低温保存备用，计算出上样体积后行酶联免疫法检测。

1.5.2 酶联免疫法检测 ①将已稀释的标准品加样50 μg于酶标板上，再加入待测样品；②用封板膜封板后置于37℃电热恒温干燥箱内，温育30 min；③揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满用蒸馏水稀释30倍的洗涤液，静置30 s弃去，如此重复5次，拍干；④每孔加入酶标试剂50 μl，空白孔除外，再次温育、洗涤；⑤每孔加入显色剂A 50 μl，再加入显色剂B 50 μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10 min；⑥每孔加终止液50 μl；⑦以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定在加终止液15 min内进行。

1.6 数据处理

2 结果

2.1 最大膀胱容量的变化

见表1。不同时间点：空白组：第7天、第14天组内比较P>0.05。模型组、电针组、中频组：第14天与第7天、治疗前比较P<0.05；第7天与治疗前比较P<0.05；模型组结果说明SUI大鼠的排尿功能在未干预的情况下有所好转。

同一时间点：治疗前：模型组、电针组、中频组与空白组比较P<0.05；模型组、电针组、中频组组间比较P>0.05。第7天：模型组、电针组、中频组与空白组比较P<0.05；电针组、中频组与模型组比较P<0.05；电针组与中频组比较P>0.05。第14天：模型组、电针组、中频组与空白组比较P<0.05；电针组、中频组与模型组比较P<0.05；中频组与电针组比较P<0.05。说明中频组的持续作用较电针组强。

表1 治疗前后各组大鼠膀胱最大容量测定结果(±s,V/ml)

注：与模型组比较，①P<0.05；与电针组比较，②P<0.05

2.2 盆底组织LOX的表达

见表2。不同时间点：空白组：第7天、第14天比较P>0.05；模型组、电针组、中频组：第14天与第7天比较P<0.05。

同一时间点：第7天、第14天：空白组、电针组、中频组与模型组比较P<0.05；空白组与电针组、中频组比较P<0.05；电针组与中频组比较P<0.05。说明电针及中频电疗法均能提高LOX的表达。

表2 各组大鼠盆底组织中LOX蛋白的测定结果(±s,ng/ml)

注：与模型组比较，①P<0.05；与电针组比较，②P<0.05

2.3 盆底组织Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量以及Ⅰ/Ⅲ比值的变化

见表3。Ⅲ型胶原蛋白：不同时间点：空白组、模型组：7天与14天比较P>0.05；电针组、中频组：14天与7天比较P<0.05。同一时间点：7天：空白组、电针组、中频组与模型组比较P<0.05；空白组与电针组、中频组比较P<0.05；电针组与中频组比较P>0.05。14天：空白组、电针组、中频组与模型组比较P<0.05；中频组与空白组、电针组比较P<0.05；空白组与电针组比较P>0.05。说明中频电的持续作用高于电针。

Ⅰ型胶原蛋白及Ⅰ/Ⅲ比值：不同时间点：空白组、模型组：7天与14天比较P>0.05；电针组、中频组：14天与7天比较P<0.05。同一时间点：7天、14天：空白组、电针组、中频组与模型组比较P<0.05；中频组与电针组、空白组比较P<0.05；空白组与电针组比较P<0.05。

表3 各组大鼠盆底Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量(μg/L)以及Ⅰ/Ⅲ比值的测定结果(±s)

注：与模型组比较，①P<0.05；与电针组比较，③P<0.05，②P>0.05

3 讨论

国际控尿协会(Intemational Continence Society,ICS)将压力性尿失禁(SUI)定义为：腹压突然增加时(如咳嗽、大笑、打喷嚏)导致尿液不自主流出，同时不伴逼尿肌的收缩。但其发病机制尚不明确，随着吊床学说及完整理论的提出,研究焦点从解剖改变逐渐转移到形态学、超微结构及生化功能方面。女性盆底是由封闭骨盆出口的多层肌肉和筋膜组成的,通过互相作用和支持，保持盆腔脏器的正常位置与功能。研究表明[4]，Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白是韧带和筋膜这些支持结构中的主要成分，其中Ⅰ型胶原直径较粗，有很高的抗张强度及支持作用，Ⅲ型胶原直径较细，与弹性有关。胶原蛋白通过广泛共价交联的纤连蛋白与蛋白聚糖连接交织构成多层次、多方面、复杂的三维空间结构，此结构将胶原蛋白与弹性纤维紧密地连接起来，使它们不溶于水，同时具有强大的弹性与韧性，并能抵抗胶原酶的水解。大量的文献证实胶原异常改变为SUI发病的重要机制[5-8]。赖氨酰氧化酶(LOX)是胶原与弹性纤维通过共价交联取得稳定性和发育成熟的关键酶，它可氧化胶原纤维的赖氨酸残基，从而启动交联的形成，增加细胞外基质的稳定性。其活性下降或含量减少会引起胶原纤维共价交联形成受阻，胶原发育障碍而使其易于遭受蛋白水解酶的溶解，使得筋膜韧带这些盆底支持结构失去应有的生物力学性质，从而导致盆底松弛和控尿基质减弱，发生SUI。

中医学认为SUI属于小便失禁，发病机制主要是肾气虚衰、下焦失于固摄。本研究所选取的会阴穴，是冲、任、督脉从小腹下出体外之交汇处，主治泌尿、生殖之证。督脉为阳脉之海总督一身之阳气，任脉为阴脉之海总任全身之阴气，冲脉为十二经脉之海能调节十二经气血与五脏六腑，故会阴穴可调节全身气血阴阳及五脏六腑，使气血充盈，脏腑调和，阴平阳秘，从而升举收摄、固摄下元。从解剖结构上看，其深处为会阴中心腱，由会阴浅横肌、肛门外括约肌和一对肛提肌以及筋膜汇合而成，当选用低频正弦调制的具有快速最大功能性电刺激中频脉冲电流刺激会阴穴时，脉冲电流可刺激盆底肌肉以及阴部神经，增加盆底肌肉的营养及强度，从而加强对尿道钳制作用和对膀胱颈的支撑，提高尿道的关闭合压力，同时对阴部神经的反射性刺激，可抑制逼尿肌的兴奋，使膀胱底部松弛，增加逼尿肌的稳定性。由此激发盆底肌的牵张反射，引起盆底肌的正性收缩。

本实验结果表明，电针组与中频组大鼠进行治疗后盆底组织中LOX表达明显上调，筋膜与韧带中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的含量明显增加，最大膀胱容量得到显著提高，且中频组的疗效优于电针组。说明脉冲调制中频电较电针更多的诱导了LOX在盆底组织中的表达，由于LOX活性、数量增多，又促进了Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的合成发育，致使胶原纤维之间交联的水平上升，物理机械性质稳定，增强了盆底支持和控尿结构的抗张力，从而改善SUI大鼠的临床症状。本课题组前期采用此方法治疗女性SUI以及子宫脱垂等盆底功能障碍性疾病取得明显疗效[9-12]，本实验为中频电疗法治疗女性SUI提供了客观依据，因此应用脉冲中频电疗法治疗女性SUI值得在临床大力推广。

[1] Hannestad YS,Rortveit G,Sandvik H,et al.Community-based epi-demiologic survey of female urinary incontinence[J].J Clin Epidemio,l2000,53:1150-1157

[2] Chmel R,Novackova M,Vlk R,et al.Epidemiological aspects of the female urinary incontinence[J].Cas Lek Cesk,2005,144(2):95-97

[3] Tiktinsky R,Chen L,Narayan P.Electrotherapy: yesterday,today and tomorrow[J].Haemophilia,2010,16(Suppl.5):126-131

[4] Fitzgerald MP,Mollenhauer J,Hale DS,et al.Urethral collagen morphologic characteristics among women with genuine stress incontinence[J].Am J Obstet Gyneco,l2000,182(6):1565-1574

[5] Rodriguez LV,Chen S.New objective measures to quantify stress urinary incontinence in a novel durable animal model of intrinsic sphineter defieieney[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2005,288(5):1332-1338

[6] MeKinnie V,Swift SE,Wang W,et al.The effect of pregnancy and mode of delivery on the prevalence of urinary and female incontinence[J].Am J Obstet Gyneeol,2005,193(2):512-517

[7] Birk DE,Mayne R.Localization of collage type Ⅰ,Ⅲ and Ⅴ during tendon development changes in collage types Ⅰ and Ⅲ are correlated with changes in fibril diameter[J].Eur J Cell Biol,1997,72:352-361

[8] Lang J,Zhu L,Sun Z,et al.Clinial study on collagen and stress urinary incontinence[J].Clin Exp Obstet Gynecol,2002,29:180-182

[9] 高潇,邢艳丽,董施秋,等.针刺配合穴位中频电刺激对女性压力性尿失禁的影响[J].针灸临床杂志,2013,29(8):15-16

[10] 闫珺,董施秋,张广美.调制中频电刺激治疗产后子宫脱垂的临床观察[J].现代养生,2014,5(10):55-56

[11] 高潇,邢艳丽,董施秋,等.穴位中频电刺激对女性压力性尿失禁的疗效观察[J].中医药信息,2013(5):106-107

[12] 夏梦,高潇,邢艳丽,等.穴位中频电刺激治疗子宫脱垂的疗效观察[J].中医药学报,2013(4):90-91

黑龙江省教育厅科学技术研究项目，编号：12541766。

邢艳丽(1958-)，女，主任医师，主要从事脑卒中综合康复的规范化临床治疗。

△通讯作者：高潇(1983-)，男，主治医师，主要从事临床康复工作。

R246.1

A

1005-0779(2017)01-0053-03

2016-07-23