匡雪君　邹丽秋　李滢　孙超　陈士林

[摘要] 结构复杂多样的天然产物是新药发现的重要源泉。通过天然产物合成生物学来实现天然产物的异源合成，被认为是解决复杂、稀缺天然产物来源问题最具前景的途径。DNA组装技术与基因组编辑技术是天然产物合成生物学研究的两大关键技术。前者可以将多个元件组装成超长DNA片段，实现代谢途径的重建，后者可以通过底盘基因组的改造，增加底盘与外源途径的适配性。该文综述了DNA组装技术与基因组编辑技术的最新研究进展，以期为天然产物合成生物学体系的构建和优化提供帮助。

[关键词] 天然产物； 合成生物学； DNA组装； 基因组编辑

Key technologies in synthetic biology of natural products

KUANG Xuejun1， ZOU Liqiu1， LI Ying1， SUN Chao1*， CHEN Shilin2*

（1.Institute of Medicinal Plant Development， China Academy of Medical Sciences and Peking Union

Medical College， Beijing 100193， China；

2. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] Natural products with complex and diverse structures are the major sources of new drugs. The biosynthesis of natural products is considered to be one of the best ways to solve the problems of complex and scarce natural products. DNA assembly technology and genome editing technology are two key technologies in the emerging interdisciplinary field of synthetic biology. A number of novel DNA assembly methods developed in the last few years have paved the way for the engineering of high molecular weight DNA molecules， including whole genomes， hence， it can realize the reconstruction of the metabolic pathways and speed up optimization process. A wide variety of new tools for microbial genome editing will be applied widely to modify the chassis genome to increase its adaptation with the exogenetic pathways. This article summarized the latest advance with respect to DNA assembly and genome editing， which aims to provide help for reconstruction and optimization of the synthetic biological systems of natural products.

[Key words] natural products； synthetic biology； DNA assembly； genome editing

doi：10.4268/cjcmm20162205

来源于植物、动物、微生物的天然产物往往天然含量低，组分复杂，提取分离难以得到单一的化合物，采用化学合成的方法也由于合成路线复杂，反应条件难以控制，合成率低，无法满足市场需求[12]。因此，采用合成生物学的方法将外源的代谢途径引入易于遗传改造的模式微生物中，实现复杂天然产物或其前体的高效生产是目前应用前景最广阔的一种方法[3]。

目前，运用天然产物合成生物学已经成功实现抗疟药青蒿素[4]、抗癌药紫杉醇[5]及长春碱[6]前体的生物合成。要实现外源途径在底盘系统中的重建并高效合成目标产物离不开2项关键技术：DNA组装技术和基因组编辑技术。前者有效地弥补了DNA化学合成长度的不足，可成功实现长达1 Mb大片段DNA的组装[7]，从而保障了含多个元件的外源合成途径的正确组装；后者可以对底盘细胞基因组进行改造，提高与外源途径的适配性，精确调控外源基因表达，减少中间产物对宿主的毒性，提高目标产物的产量[8]。

1 DNA组装技术

采用DNA从头合成技术产生的DNA片段长度大多为500～1 000 bp，当合成更长的DNA片段时则需要将DNA小片段按顺序组装起来，这就涉及DNA组装技术[910]。将基因元件组装为可复制的和表达的DNA分子对于代谢途径或基因环路的构建是非常关键的，DNA组装方法用于基因环路的设计和特征化不仅有助于细胞内及细胞间调控机制的理解，而且能加速途径优化进程；此外，DNA组装方法可以通过激活天然产物生物合成相关的隐藏或沉默的基因簇来发现新型天然产物[1112]。基于不同的机制，DNA组装技术可分为四大类：基于限制性内切酶的组装、基于寡核苷酸架桥的组装、基于同源重组的体外组装和基于同源重组的体内组装。

1.1 基于限制性内切酶的方法

1.1.1 依赖于同尾酶的BioBrick/BglBrick 同尾酶（如BglⅡ和BamHⅠ，XbaⅠ和SpeⅠ等）是一类识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能产生相同黏性末端的限制性内切酶[13]。Biobrick是首个实现标准生物元件（如启动子、核糖体结合位点、开放阅读框、编码序列和终止子等）顺序组装的DNA组装方法[14]。该法运用限制酶切和连接不仅能完成标准生物元件的平台构建，由于元件之间兼容，也能对形成的元件重新装配，组装成大型DNA片段。每个DNA元件上游与EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点相邻，下游与SpeⅠ和PstⅠ酶切位点相邻。同尾酶XbaⅠ和SpeⅠ识别不同的酶切位点，产生相同的黏性末端，一旦2个DNA元件连接，元件之间产生疤痕序列（ACTAGA），原来的酶切位点将不复存在，也就不能被原有的限制酶所识别，所以连接产物用XbaⅠ或SpeⅠ酶切均不能将其消化[15]。需要注意的是元件与质粒骨架上不能有同尾酶酶切位点。Biobrick连接后的疤痕序列（ACTAGA）翻译后为苏氨酸精氨酸，不会产生移框突变和提前终止，可用于融合蛋白的表达。近来出现的BglBrick[16]改进了原始的BioBrick法，DNA元件侧翼相邻的是甲基化的不敏感的酶BglⅡ和BamHⅠ，大大提高了连接效率，疤痕序列（GGATCT）编码甘氨酸丝氨酸，故BioBrick也能用于蛋白融合。BioBrick和BglBrick 1次连接2个DNA片段，仅利用一对同尾酶，就可以实现DNA片段的多次组装[13]。

1.1.2 Golden gate 克隆法 Golden gate 克隆法利用Ⅱ型限制性内切酶（ⅡS型酶，如BsaⅠ和AarⅠ）对DNA识别序列的相邻的特定位置进行剪切，利用同种限制酶产生不同的黏性末端（4个核苷酸的悬突），消化片段连接的产物没有初始的酶切位点[17]。此方法允许37°酶切消化和16°连接环化一步完成，且克服传统多片段组装时限制酶种类的限制，还可进行无缝连接[18]。由于Golden gate 克隆可用于重复序列的组装，基因组编辑工具转录激活样效应子核酶（TALENs）蛋白的DNA结合结构域是由序列差异很小的多个模块组成，所以可以对TALENs进行人工设计组装[19]；该方法也可用于基因环路的构建，陈威华等[20]使用可识别甲基化序列mCNNR（R=A或G）的内切酶MspJⅠ开发MASTER（methylationassisted tailorable ends rational），并利用该方法成功克隆了29 kb的天蓝色链霉菌放线紫红素生物合成基因簇。MASTER用含有5甲基胞嘧啶的引物扩增需要组装的片段，限制性内切酶仅消化目标终端序列，更适于组装长的DNA片段，但是甲基化引物相对昂贵，并且长片段DNA的扩增可能会引入错误。

1.2 基于寡核苷酸的架桥法

连接酶循环反应（the ligase cycling reaction， LCR）利用热稳定的连接酶和寡核苷酸进行组装[21]。LCR使用架桥寡核苷酸连接不具有重复序列的片段，每个架桥寡核苷酸含有与待连接DNA片段末端互补的序列，使上游片段的3′与下游片段的5′连接，从而使2个DNA片段组装成单个的线性片段[22]。近来，De 等运用这项技术将12个DNA片段组装到一个20 kb的质粒上[23]。

1.3 基于体外同源重组的组装

1.3.1 重叠延伸PCR技术 重叠延伸PCR技术（splicing by overlapping extension PCR，SOEPCR），又称交错延伸剪接PCR技术或套叠PCR技术[24]。该技术采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成相互重叠的链，在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段拼接起来[25]。不需要限制性内切酶消化和连接酶处理就可实现任意2个目的基因的连接，同时由于不引入目的基因以外的其他序列，可避免因加入连接序列导致的表达蛋白功能异常[24] 。Tan等[26]利用此技术和长片段PCR结合使用，并且在实验中采用高保真聚合酶 pfu 的校正功能，成功地组装了不同的长度DNA 分子，拼接长度可达20 kb，融合的错误率仅有1/16 600。此技术可用于2个或2个以上异源基因DNA片段的拼接，并且在插入大片段的定点突变、敲除基因片段以及基因的体外分子进化研究上具有独特的优势[26]。

1.3.2 序列及连接非依赖性克隆 序列及连接非依赖性克隆法（sequence and ligationindependent cloning，SLIC）利用T4DNA聚合酶，产生独特的互补末端，然后采用单链退火或RecA介导的体外重组，从而实现DNA片段的拼接[2728]。SLIC法虽然1次可组装超过10个片段，但需要很长的DNA重叠区，如组装4个片段需要至少40 bp长的重叠区[27]。为了减少重叠区的DNA长度，降低引物合成费用，Zhang等随后开发出SLiCE （seamless ligation cloning extract）方法，采用廉价的大肠杆菌细胞提取物驱动同源重组介导的DNA组装，极大的减少了花费[29]。

1.3.3 USER克隆法 采用USER（uracilspecific excision reagent）克隆法可以实现DNA序列与载体的连接[30]。首先在载体上加上一小段cassette，cassette区域含有载体上不存在的限制性内切酶识别位点，且在识别位点两端加上2个不同的碱基对控制方向，反方向的链上加上2个切口酶识别位点[31]。改造后的质粒用限制性内切酶和切口酶处理后，产生8个碱基对的悬突。组装片段之间共有的重叠片段均以腺嘌呤起始，并以胸腺嘧啶结束，长度为6～17 bp。采用特定的寡核苷酸来扩增连接片段，重叠区域3′的胸腺嘧啶残基被尿嘧啶替换，校对聚合酶能读取尿嘧啶碱基（如Pfu Turbo Cx或Phusion U），然后将质粒骨架、双链DNA片段与USER混合酶混合[32]。混合酶中含有尿嘧啶DNA糖苷酶（催化尿嘧啶的删除，形成一个脱碱基位点）、DNA糖苷酶裂解酶（断裂磷酸二酯骨架，释放无碱基的脱氧核糖单糖），所有的片段形成互补的5′悬突，自退火形成带有单链裂痕的环状分子，然后转化到宿主进行修复[33]。组装的DNA片段之间是无痕连接，但是用来改造载体的cassette会给DNA片段与载体之间带来13个碱基的疤痕[31]。

1.3.4 Gibson组装 Gibson组装要求将多个具有重复序列的DNA片段和线性化的载体混合，同时加入3个酶的混合物，分别为：T5核酸外切酶（使所有DNA片段产生一个3′的悬突，重叠的部分自动退火）、Phusion聚合酶（填补和连接缝隙）和Taq连接酶（修复裂痕，产生完整的目标产物）[34]。Gibson等运用此方法2 d内可将75个284 bp的DNA片段组装成整个的老鼠线粒体基因组（16.3 kb）[35]。Gibson组装方法不仅可实现无缝拼接，而且组装尺度也十分可观，不仅适用于以寡核苷酸链为起始的DNA合成，也适用于构建长的DNA片段，甚至是基因组[36]。该法具有快速、简便、易行等特点，但因其中酶的造价较高，在大规模使用时，不得不考虑成本。T5核酸外切酶可以完全破坏<250 bp的DNA片段，所以组装的片段长度需>250 bp。如果片段长度<250 bp可以在Gibson组装之前使用重叠延伸PCR等技术使其长度达到要求[37]。

1.4 基于体内同源重组的组装

为了组装得到更长的DNA序列，除了体外的Gibson组装等方法，科学家们将注意力转移到了体内同源重组，包括枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和酿酒酵母重组系统。

1.4.1 酵母体内组装 酵母同源重组频率高，并且拥有精确的DNA修复机制，使其成为同时组装多个DNA片段理想的底盘细胞[38]。酵母同源重组可以有效连接有40 bp重叠序列的DNA片段，Kuijpers等[39]改进了这一方法，通过使用60 bp与酵母基因组不同源的重组序列将9个DNA片段组装到一个21 kb的质粒上，装配成功率达到95%。近来，出现了一个改进的RADOM（rapid assembly of DNA overlapping multifragments） 组装方法[40]， RADOM法将酵母同源重组与大肠杆菌的蓝白斑筛选结合起来，大大减少了组装时间。通过提取酵母转化株中的质粒转化入大肠杆菌，借助蓝白斑筛选可以区分携带组装DNA片段的载体与空载体，所以能快速地完成大规模的阳性菌株的筛选，已经被成功用于3 kb和10 kb酵母染色体的组装。

除了DNA组装，酵母同源重组也常用于将外源DNA整合到基因组上，用于代谢工程与复杂酶途径的构建[41]。最近发展起来的CasEMBLR法能将没有标记的DNA片段插入酵母染色体多个位点，利用CRISPR/Cas9系统在基因组目标插入位点引入双链DNA断裂，通过同源重组极大的提高了染色体插入效率，此法已被用于将类胡萝卜素途径中的15个基因整合到酵母中3个目标位点和将酪氨酸合成途径中的10个酶基因整合到2个目标位点[42]。

1.4.2 枯草芽胞杆菌体内组装 杆状的革兰氏阳性菌枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis也是合成生物学研究中是一个频繁使用的宿主。Hao等[43]在芽胞杆菌中建立了一套较为完善的不同尺度DNA组装体系，“Culture mix method”用于上百kb的直接克隆，“Domino method”用于几kb到上百kb的组装，“Inchworm method”用于几Mb基因组的拼接。枯草芽胞杆菌基因组（B. subtilis genome，BGM）载体系统是一个新型的克隆系统，使用整个枯草芽胞杆菌的基因组作为载体，引入的外源DNA可以以一种单链的形式转化进入枯草芽胞杆菌细胞质，通过RecA介导的同源重组将多个大型DNA片段整合到枯草芽胞杆菌染色体上。BGM含有4.2 Mb枯草芽胞杆菌全基因组，允许大型DNA片段的整合。2005年，Itaya等采用“inchworm method”法成功将集胞藻Synechocystis基因组（3.5 Mb）导入到枯草芽胞杆菌中，构建了1个7.7 Mb的集成基因组[44]。然而，该方法需要100 kb以上的DNA片段作为模板，其应用受到了限制。于是，相继开发了“Domino method”，借助BGM载体系统，利用同源重组原理与逐级添加模式，已经被用于克隆16.3 kb的老鼠线粒体基因组和134.5 kb的大米叶绿体基因组[45]。“Domino method”不要求纯化长链DNA模板，并且促进DNA稳定的插入BGM，但由于比较耗时，组装过程需长的同源臂，目前还未得到普遍使用。2010年，Itaya及其同事们[46]发现，含有大质粒（>100 kb）的大肠杆菌被噬菌体侵染后，其中的大质粒仍能够稳定存在。当直接混合大肠杆菌裂解液与芽胞杆菌感受态细胞，可以将DNA大片段稳定整合到芽胞杆菌的基因组上，随即开发了“culture mix method”，利用这种天然转化方式，实现了DNA大片段的直接克隆。

1.4.3 大肠杆菌体内组装 和酿酒酵母和枯草芽胞杆菌不同的是，不能转化线性的DNA片段进入大肠杆菌Escherichia coli，因为线性的dsDNA会被依赖于ATP的核酸外切酶RecBCD分解[47]。基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统频繁被用于将DNA整合到大肠杆菌中，介导线性DNA分子与环状的质粒发生同源重组[48]。λ噬菌体主管同源重组的重组酶系统称为Red，包含3种蛋白质分子，分别称为Exo，Beta和Gam。Exo蛋白是具有5′3′活性的核酸外切酶，结合到dsDNA末端，通过消化5′ DNA末端产生3′ ssDNA悬突；Beta蛋白与ssDNA悬突结合，退火与ssDNA结合；Gam蛋白抑制核酸外切酶RecBCD结合到dsDNA的末端[47]。Ssbri等用该系统的KIKO（knockin/knockout）载体成功将5.4，7.3，11.3 kb的DNA片段整合到大肠杆菌基因组中[49]。近来，λ噬菌体Red重组酶介导的同源重组与噬菌体80Int介导的位点特异性同源重组结合的技术也被运用于染色体整合，如将8 kb的DNA片段整合到大肠杆菌染色体上[50]。

Rac原噬菌体也可用于大片段DNA在大肠杆菌中组装。Rac原噬菌体的RecE/RecT重组系统功能上与噬菌体λ的Red蛋白重组酶系统类似（RecE 和RecT分别与Exo 和 Beta类似）[51]。研究显示噬菌体λ的Red蛋白重组酶系统适用于线性和环状DNA分子的结合，而Rac的RecE/RecT 系统更适用于2个线性DNA分子的连接[52]。

2 底盘基因组的编辑技术

采用基因组编辑技术几乎可以对任意基因进行编辑和修饰[8]。近年来，基因组范围的高效编辑技术发展迅速，对宿主基因组的改造效率也不断提升，能更加有效地解决宿主菌株改造中的许多瓶颈问题，例如：大片段基因组的改造、复杂表型的改造、基因组上多重位点的组合优化和不需抗生素进行辅助筛选的高效基因组修饰等[53]。此外，对宿主基因组进行适当精简，只保留存活所需的“必须基因”，能大大改善宿主细胞对底物、能量的利用效率[54]。

2.1 ZFNs

锌指核酸酶（zincfinger nucleases， ZFNs）是第一种通过人工改造并成功应用的核酸内切酶，由负责DNA特异识别的锌指蛋白 （zinc finger protein，ZFP）和FokⅠ核酸内切酶融合而成[55]。其N末端为锌指蛋白DNA结合域，由一系列Cys2His2锌指蛋白串联而成，识别并结合特异的三联体碱基；C末端为非特异性核酸内切酶FokⅠ结构域，只有当2个ZFN单体同时与各自的DNA位点结合时才能形成有切割活性的FokⅠ二聚体，从而在靶位点将DNA切断。由于 FokⅠ内切酶需要形成二聚体方能发挥活性，所以由随意剪切产生的脱靶几率会大为减少。使用者只需针对目的基因设计8～10个锌指结构域， 再将这些锌指结构域与核酸内切酶结合，就构建好了靶向特定位点的 ZFNs[56] 。ZFNs的应用研究开始较早，目前以其为基础的基因治疗药物已经进入临床研究阶段，同时，在生物制药领域的应用也比较成熟，但是ZFNs的设计筛选费时费力，而且可能存在一定的脱靶率，使其未能成为广泛应用的常规技术[57]。

2.2 TALENs

转录激活子样效应因子核酸酶（transcription activatorlike effector nucleases， TALENs）与ZFNs类似，由转录激活因子样效应物（transcription activatorlike effector， TALE）和FokⅠ核酸酶组成[58]。TALE蛋白以重复可变双残基RNDs对应1个碱基的识别模式结合到靶标DNA序列上。FokⅠ核酸酶只有形成二聚体时才能发挥其剪切酶的活性，所以，为了便于FokⅠ核酸酶的切割结构形成二聚体，通常设计2个结合位点接近的TALEN单体。Christian等[59]研究发现，2个TALEN单体的靶点间距在13～30 bp时活性比较高，其中间距为15 bp时该核酸酶的活性最高。目前，TALENs已经在植物、动物、酵母细胞中得到应用，有潜力成为一种操作方便、特异性强的基因组定点修饰技术[60]。

2.3 CRISPR/Cas9

规律成簇间隔短回文重复（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9系统能进行基因组的高效修饰[61]。该系统由蛋白质和RNA 2个部分组成，蛋白质即切割DNA的Cas9核酸内切酶，RNA指导Cas9核酸内切酶定位到基因组的靶标位点[62]。CRISPRCas9系统属于细菌适应性免疫系统，不同的CRISPRCas9系统分为3种类型，类型Ⅰ和类型Ⅲ利用多个Cas9蛋白引起靶标DNA的断裂，类型Ⅱ只需利用1个Cas9内切酶就能在目标基因组序列引入双链DNA断裂，通过与经过特殊设计的小向导RNA（single guide RNA）共表达发挥作用[63]。CRISPRCas9系统是基因组编辑的一个重要的工具，已经被成功地用于链霉菌中放线菌紫素合成途径基因簇的失活。对该技术进行改造产生了CRISPRdCas9技术，CRISPRdCas9不切割DNA，而是与转录激活剂或抑制剂蛋白结构域结合，靶标基因组中相关基因的启动子来激活或抑制基因的表达，故可以使用这项技术来进行异源宿主中途径产量的优化[64]。CRISPR/Cas9系统与ZFNs和CRISPR/Cas9相比，具有更好的扩展性，且更加经济高效、易于构建。目前此项技术已经成功地用于天然产物紫色杆菌素合成途径中中间产物和终产物的优化[61]。

2.4 基于位点特异性重组酶的同源重组

基于位点特异性重组酶的基因组编辑是一个有效的工具。现在大多利用来源于P1噬菌体的Cre/loxP位点和来源于酵母的Flp/FRT位点催化2个特异DNA序列发生重组[65]。Cre和Flp都属于酪氨酸重组酶类，分别识别34 bp的目标位点——loxP和FRT，并且催化发生位点特异性重组[66]。应用这些重组酶进行基因组编辑，其原理是在基因组上和目的 DNA 上均插入特异性识别序列，在相应的重组酶作用下进行重组，实现大片段 DNA 的插入、删除或替换。在基因组上目的片段两端分别插入2个重组酶识别位点；同样地，外源片段含有相应重组酶识别位点；通过重组酶的过量表达，即可实现2个特异识别位点之间基因组 DNA 的替换操作[67]。CreloxP重组系统在酿酒酵母中已经使用得比较成熟，已被成功用于引起单基因或者双基因的删除，也能用于大肠杆菌中基因的删除[66]。

2.5 基于转座子的同源重组

转座子（transposon）是存在于DNA上可自主复制和移位的基本单位[68]。转座子分为简单转座子和复合式转座子。简单转座子因没有任何宿主基因，被直接称为插入序列，是染色体或质粒DNA的正常组成部分[69]。插入序列都是可以独立存在的单元，带有协助自身移动的蛋白；复合式转座子是另一类带有某些抗药性基因或其他宿主基因的转座子，其两翼往往是2个相同或高度同源的插入序列。基因转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段3～12 bp的靶序列DNA会自我复制，使插入的转座子位于2个重复的靶序列之间[70]。不同转座子的靶序列长度不同，但对于一个特定的转座子来说，所复制的靶序列长度都是一样的。对于序列已知的目的基因，可利用转座子将该片段引入宿主细胞内，然后筛选突变的DNA序列替换野生型亲本DNA序列，通过对突变基因的测试来研究相关基因的功能[71]。

3 展望

近年来，DNA合成与组装技术发展迅速，已在合成生物学、遗传网络设计和基因组合成方面获得了广泛的应用。但是目前的DNA合成与组装技术也存在一些问题，例如通量低、错误率高、自动化程度低、成本高等，通过学科间的交叉合作，开发新的合成策略，研制新的试剂或酶，有望加快DNA组装技术的研究进程。同时，新型基因组编辑技术也不断推陈出新，在基因组改造和优化方面表现出巨大的潜力和广阔的应用前景。但这些技术的快速发展也面临一些问题，如一些高效的基因组编辑技术只能在少数遗传操作的模式菌中应用，难以应用到其他微生物。随着DNA组装技术和基因组编辑技术的不断发展和完善，两者将会在合成生物学和其他生命科学领域研究与应用中发挥更重要的作用。

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