肖水明　白瑞　张小燕

[摘要] 基因作为中药体内代谢及药效发挥的基础，以基因表达、调控及修饰为研究方向，进行中药多组分、多环节、多靶点的体内代谢研究，有助于中药体内代谢过程、作用靶点和分子机制研究取得突破性进展。人作为一个超级生物体，1%的基因遗传自父母，其余99%的基因来自分布人体各部位，主要源自肠道菌群的微生物，即人体自身基因组和“第二基因组”分别从遗传和“环境”角度对中药体内代谢产生影响。该文以典型研究案例为线索，探讨中药体内代谢基因组相关研究，主要包括中药基因组和肠道宏基因组研究，以及基于上述（宏）基因组个体差异引发的个体化医疗。

[关键词] 中药； 体内代谢； 中药基因组学； 肠道宏基因组学； 个体化医疗

Genomic research of traditional Chinese medicines in vivo metabolism

XIAO Shuiming1*， BAI Rui2， ZHANG Xiaoyan3

（1. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences，

Beijing 100700， China；

2.College of Pharmacy and Chemistry， Dali University， Dali 671000， China；

3. College of Life Science， Huaibei Normal University， Huaibei 235000， China）

[Abstract] Gene is the base of in vivo metabolism and effectiveness for traditional Chinese medicines （TCM）， and the gene expression， regulation and modification are used as the research directions to perform the TCM multicomponent， multilink and multitarget in vivo metabolism studies， which will improve the research on TCM metabolic proecess， effect target and molecular mechanism. Humans are superorganisms with 1% genes inherited from parents and 99% genes from various parts of the human body， mainly coming from the microorganisms in intestinal flora. These indicate that genetically inherited human genome and "second genome" could affect the TCM in vivo metabolism from inheritance and "environmental" aspects respectively. In the present paper， typical case study was used to discuss related TCM in vivo metabolic genomics research， mainly including TCM genomics research and gut metagenomics research， as well as the personalized medicine evoked from the individual difference of above genomics （metagenomics）.

[Key words] traditional Chinese medicines（TCM）； in vivo metabolism； TCM genomics； gut metagenomics； personalized medicine

doi：10.4268/cjcmm20162204

中药体内代谢研究是阐明中药作用机制的重要途径，也一直是中药现代化研究的难点。虽然同是用于疾病治疗的药效物质，中药是与化学药物迥然有别的复杂生物体系，它作用于人体时响应的是多维非线性的复杂效应[1]。很多中药的疗效经过长期临床实践已经得到证实，但进入体内发挥药效的化学成分及其体内过程并不清楚。研究中药体内代谢可以了解中药在体内的代谢途径、存在形式、影响因素以及药效物质基础。中药体内代谢及药效发挥的基本环节是药物分子与机体生物分子之间的直接或间接的相互作用，引起从遗传信息到整体功能实现中的多个层面的结构与功能状态的改变，而决定这些层面的结构与功能的基础是基因。因此，以基因表达、调控及修饰为研究方向，进行中药多组分、多环节、多靶点的体内研究，可能有助于阐明中药体内代谢过程、作用靶点和分子机制[2]。同时，人作为一个超级生物体，只有1%的基因遗传自父母，其余99%的基因都来自分布人体各部位的微生物，其中肠道是微生物定植数目最高的器官[34]。因而，肠道微生物基因组被誉为“人类的第二个基因组（our other genome）”[5]。

近年来，基于“基因组学”的技术在中药体内代谢领域进行了有益的探索。本文将以典型研究案例为线索，探讨中药体内代谢基因组相关研究，主要包括中药基因组学和肠道宏基因组学研究。

1 中药基因组研究

王升启[6]于2000年提出了中药基因组学（TCM genomics）的概念，即以药物基因组学（pharmacogenomics）理论为基础，将中药的药性、功能及主治与其在人体内代谢/疾病相关基因表达调控相关联，在分子水平研究中药在人体基因组介导下的代谢转化、作用靶点、毒副反应、药效机制和中药整体化作用的规律。中药基因组学的核心内容是应用基因组信息和方法在人类基因组水平研究中药体内代谢和反应的遗传学本质。陈士林等[7]关于中药基因组学的理解，则侧重于中药本身，主要包括中药转录组学、结构基因组学、基因组标记解析和功能基因组学等，属于本草基因组学（herbgenomics）的研究范畴[8]，旨在通过对中药原物种遗传信息的揭示，解析重要活性产物的生物合成途径，发掘参与生物合成的功能基因，推动对中药合成生物学、基因组辅助分子鉴定和分子育种及中药道地性遗传机制阐释的深入研究。

药物基因组学是基于药物反应的遗传多态性提出来的，表现为药物代谢酶、受体和靶标的多态性等。这些多态性的存在可能导致许多药物治疗中药效和不良反应的个体差异，这种情况在中药体内代谢过程中将更为复杂。传统中药以口服用药为主，中药成分在体内发生代谢的部位主要有胃肠道、肝脏、肾脏和肺等组织器官，其中肠道和肝脏是多数药物的主要代谢器官。除中药原型成分外，还可能有大量代谢产物的存在，其中的药效成分作用于受体、酶、离子通道等靶点，最终产生药效。中药体内的反应和代谢涉及多基因的相互作用，基因多态性导致药物体内代谢反应多样性，从而为从基因组水平研究中药体内代谢和药物反应奠定了基础。相比于遗传药理学（pharmacogenectics）着重于药物在代谢动力学和药物效应动力学方面单个或少量基因的研究，中药基因组学的研究范畴更广，包括全基因组上决定中药药物效应的所有基因，系统性地评价基因的相互作用及其如何影响疾病的易感性、药理学功能、药物处置和治疗反应，并以此为平台指导中药新药的开发及合理用药。

遗传药理学是药物基因组学的一种雏形，它从单基因的角度研究遗传因素对药物代谢和药物反应的影响，特别是遗传因素引起的异常药物反应。总体而言，个体对药物代谢和反应差异的15%～30%是由基因因素决定的，个别药物基因因素的影响可以占到95%[9]。中药基因组学目前主要关注中药作用机制、毒副作用、有效成分和药物靶点等研究[10]，进一步从表型到基因型的中药反应个体多样性研究相对较少。Lee等[11]发现由芍药根诱导的肝细胞凋亡早期其BNIP3基因表达上调，而ZKl，RAD23B及HSPDl基因表达下调，提示芍药根抗肿瘤活性的机制可能与促进细胞凋亡相关；Watanabe等[12]通过观察服用银杏叶提取物（GBE）小鼠皮层及海马组织的基因表达变化，发现皮层内微管相关蛋白、钙离子通道及催乳素等多种与脑功能相关的基因表达的上调，而海马组织内则仅有甲状腺转运蛋白上调，表明GBE可能通过对淀粉样蛋白清除而发挥神经保护作用；Zhang等[1314]构建了栀子苷治疗缺血性模型大鼠的基因表达谱芯片，结果表明栀子苷对局灶性脑缺血大鼠脑组织基因表达具有调控作用，从分子水平阐述了中药清开灵注射液成分栀子苷的药理作用机制；张立平等[15]筛选肝肾阴虚型晚期结直肠癌（CRC）患者使用六味地黄颗粒前后的显著差异表达的基因，干预后129个差异基因，其中128个上调，1个下调。基因功能（GO）富集分析结果显示，干预前后共254个基因GO存在显著差异。在生物过程中，凝血功能相关的基因占41.5%；在细胞组成中，45.5%的差异基因与细胞质膜有关；在分子功能方面，64.9%的差异基因与结合有关。上述结果表明六味地黄颗粒可增强患者凝血功能，增加钙离子结合。

此外，随着中西药联用在我国临床上日趋广泛的应用，中药通过影响药物代谢酶或转运体基因表达和功能改变其底物药物的血药浓度，可能导致临床上药物毒副反应或治疗失败的发生，产生有重要临床意义的中药药物相互作用。高立臣等[16]对药物代谢相关基因介导的中药药物相互作用研究进行了系统的总结。Wang等[17]发现贯叶连翘Hypericum perforatum诱导细胞色素CYP2C19对奥美拉唑的羟化活性和CYP3A4对奥美拉唑的磺化作用，且这种影响具有CYP2C19和CYP3A4基因型依赖性；同时贯叶连翘可诱导CYP2C9对降糖药格列齐特的代谢活性，但这种影响不具有CYP2C9基因型依赖性。

下列3个案例分别从青蒿琥酯抗肿瘤效应，莨菪亭抗药性以及银杏叶提取物对药物代谢酶CYP的影响以及对其他药物药效学的影响等方面，对中药基因组相关研究展开介绍。

1.1 青蒿琥酯抗肿瘤的作用机制研究 研发新的药物及治疗策略以克服肿瘤药物抗性是目前临床肿瘤学最紧迫的任务之一。Sertel等[18]在过去几十年里，系统分析了中药里的药用植物中具有对肿瘤细胞毒性活性的次级植物代谢产物。在诸多的天然产物中，青蒿素及其衍生物青蒿琥酯（artesunate，ART）表现出明显的体内外抗肿瘤活性[19]，但其抗肿瘤的分子机制并不明确。Sertel等[20]采用了基因芯片技术，在转录水平解析青蒿琥酯抗肿瘤机制相关的基因。再将表达谱数据导入信号通路分析和转录因子分析，结果表明cMyc/Max可能是作为肿瘤细胞应对青蒿琥酯效应基因的转录调控因子。

在确定青蒿琥酯对具有顺铂（cisplatin）、阿霉素（adriamycin）和紫杉醇（paclitaxel）抗性的卵巢癌细胞的细胞毒性后，采用基于基因芯片的转录组mRNA表达谱和COMPARE分析的基因捕获技术，鉴定出一系列表达量与ART高/低半抑制浓度（IC50）相关的基因。这些基因涉及的生物学功能包括核糖体结构组成（RPL29），ATP结合级联转运（ABCC3），激酶（PRKCSH， ITPK1， IKBKG， DDR2），细胞抗氧化防御和致癌性（ATOX1），肌动蛋白细胞骨架（RRAS），致癌性（SMAD3， WNT7A），细胞黏附及恶性细胞增殖（ST8SIA1），细胞增殖与凋亡（CSE1L），细胞循环、分化（S100A10）和转移（HMGA1， RPSA）等，上述可能是肿瘤细胞应对ART的抗性或增敏因子作用途径。针对信号传导的通路分析表明，ART处理与肿瘤坏死因子（TNF）和肿瘤抑制因子p53信号通路相关，其网络结构涉及细胞形态、抗原呈递和细胞介导的免疫反应相关（图1 A），以及神经系统发育与功能、细胞组装和架构（图1 B）。

另一方面，实验结果也发现与ART作用后细胞应激无明显功能相关性的基因，如耳蜗内外毛细胞相关基因。Sertel等认为ART影响转录因子活性，进而调节涉及肿瘤细胞应对ART的下游基因的表达。在之前的研究中，作者发现cMyc的表达量与ART药物敏感性相关[21]，表明cMyc转录调节在介导ART细胞毒性效应中可能起作用。通过ConSite检测转录因子结合位点，56个基因中，大部分分别具有1～12个潜在的cMyc结合位点；只有3个基因启动子不具有cMyc结合位点，这提示cMyc可能是ART细胞反应重要的转录调节因子。Max基因作为cMyc二聚体伴侣分子，作者以关联分析验证了cMyc/Max的mRNA表达量与ART作用于细胞株的IC50的关联性。

综上，cMyc/Max介导的基因表达转录调控，可能有助于提高ART对癌细胞的细胞毒性作用以及对肿瘤的治疗效果，同样也避免因为疗效无关基因表达差异导致的不必要的毒副作用。

1.2 莨菪亭在肿瘤细胞中的抗药性研究 抗药性和不良/副反应是抗肿瘤药物新药研发中必须面对的问题。莨菪亭（scopoletin），来自艾属植物以其他植物的香豆素类化合物，其化学名为6羟基7甲氧基香豆素。香豆素类化合物具有广泛的药理活性，如抗炎、抗菌、扩张血管、抗凝血、抗血栓、退热、镇静等，特别是抗肿瘤及防治尿酸血症方面活性，已引起广泛的关注。戴岳等[22]发现东莨菪素具有抑制体内外血管生成作用，其机制主要是通过抑制内皮细胞的增殖这一环节起效。此外莨菪亭可引起细胞膜完整性缺失和细胞凋亡，具有细胞毒性作用，可诱导肿瘤细胞凋亡[23]。上述结果表明，莨菪亭是一个潜在的用于癌症治疗的抗肿瘤化合物。

Seo等[24]采用基于NCI细胞系的基因芯片RNA表达谱技术探究莨菪亭在肿瘤细胞中的药物基因组学反应。结果表明，细胞对于莨菪亭的反应与经典药物抗性机制（ABCB1，ABCB5，ABCC1和ABCG2）的ATP结合盒（ATPbinding cassette， ABC）转运蛋白的表达并不相关。同样不相关的还包括致癌基因EGFR的表达和抑癌基因TP53的突变状态。然而，致癌基因RAS的突变和以细胞倍增时间表征的增殖活性与莨菪亭抗性显著相关。基于转录组水平的mRNA表达数据经COMPARE和等级聚类分析鉴定出一组40个基因（图2），这些基因在其启动子序列上均有转录因子NFκB的结合基序（binding motifs），而NFκB已知和药物抗性相关。致癌基因RAS突变，低增殖活性和NFκB的表达可能妨碍了莨菪亭的药效。基于计算机模拟的分子对接研究发现莨菪亭与NFκB及其调控子IκB相结合。莨菪亭激活SEAP驱动的NFκB报告细胞株中的NFκB基因，提示NFκB可能是莨菪亭抗性因素之一。

综上，因其良好的抗肿瘤细胞活性，莨菪亭将成为肿瘤药物研发的关键化合物，哪怕NFκB信号通路的活化可能成为其抗性因素。目前需要更多的证据以探究莨菪亭的治疗潜力。

1.3 银杏提取物对不同CYP基因型的代谢影响 银杏叶提取物（Ginkgo biloba extract）含有160多种成分，主要为黄酮苷、萜内酯和有机酸等，具有调节血管、增强认知力、缓解压力等药理作用[25]。随着银杏制剂的广泛应用，与其他药物合用的机会越来越多，因此研究银杏叶提取物对药物代谢酶的影响以及对其他药物药效学的影响在临床应用中具有实践意义。中药对细胞色素P450酶（cytochrome P450， CYP450）及其药物转运体的诱导和抑制是介导中草药药物相互作用和产生药物临床毒副反应的主要机制。中草药能够通过影响药物代谢酶或转运体基因表达和功能改变其底物药物的血药浓度，可能导致临床上药物毒副反应或治疗失败的发生，产生有重要临床意义的中草药药物相互作用[16]。CYP2C19是CYP450酶第二亚家族中的重要成员，对药物的Ι相代谢反应起着关键性作用，而研究表明银杏叶提取物引起具有显著的诱导CYP2C19活性效应[26]。

Yin等[27]研究了不同CYP2C19基因型个体服用银杏叶提取物片剂与奥美拉唑（omeprazole，广泛使用的CYP2C19底物，适用于胃溃疡、十二指肠溃疡，应激性溃疡等）后潜在的中草药药物互作关系。18位经过CYP2C19基因分型的健康志愿者纳入研究。在基线和为期12 d的银杏用药（140 mg）后分别服用奥美拉唑（40 mg），采集服用奥美拉唑12 h血样和24 h尿样。HPLC测定血样与尿样中奥美拉唑及其代谢物浓度，包括5羟基奥美拉唑和奥美拉唑砜，并计算非房室药代动力学参数。

相比于基线水平，服用银杏后，奥美拉唑和奥美拉唑砜血药浓度显著降低，3种CYP2C19基因型[纯合子强代谢型（HomoEM），杂合子强代谢型（HetEM）和弱代谢型（PM）]的奥美拉唑AUC0∞平均下降41.5%，27.2%，40.4%。相应地，奥美拉唑砜下降41.2%，36.0%，36.0%，两者AUC0∞无显著变化。同时，AUCOPZ和AUCOPZSUL在服用银杏提取物前后均显著相关（Spearman相关系数分别为rs=0.88，P<0.001；rs=0.94，P<0.001）。银杏提取物服用前后奥美拉唑的tmax无显著变化，然而，t1/2在服用银杏提取物后显著缩短；而5羟基奥美拉唑显著增加，HomoEMs，HetEMs和PMs的5羟基奥美拉唑AUC0∞分别增加37.5%，100.7%，232.4%。基于奥美拉唑和5羟基奥美拉唑血药浓度的变化，HomoEMs，HetEMs和PMs的AUCOPZ/AUCOHOPZ（奥美拉唑羟化酶活性指标）分别下降42.3%，50.3%，70.6%。值得注意的是，PMs的AUCOPZ/AUCOHOPZ要显著高于其他2种EMs。奥美拉唑与5羟基奥美拉唑的血药时间曲线下面积（AUC）比值显著降低，且弱代谢型（PMs）降低幅度大于强代谢型（EMs）。奥美拉唑和奥美拉唑砜的AUC比值无显著变化。5羟基奥美拉唑的肾脏清除在服用银杏后显著下降，但变化程度在3种CYP2C19基因型中无显著差别。结果表明，银杏诱导CYP2C19基因型模式依赖的奥美拉唑羟基化反应，随后降低5羟基奥美拉唑肾脏清除率。银杏和奥美拉唑或其他CYP2C19底物共同服用可显著减弱其药效，但还需更多的证据支持。

2 肠道宏基因组研究

然而，遗传多态性无法单独解释相同剂量的同种药物在遗传背景一致的实验动物中不同的药代学和毒理学反应[28]。除遗传外，年龄、疾病、营养状况、生活习惯、肠道菌群均可能影响或参与药物体内代谢[2931]。正常成年人肠道内1×1013～1×1014个细菌，约1 000种不同种类，编码基因数为人体基因的100倍以上[3233]。肠道菌群基因组总和，即肠道宏基因组（gut microbiome）提供了宿主自身不具备的酶和生化代谢途径，参与外源异生物质的体内代谢，使肠道成为药物转化独特而重要的场所[28]。而肠道宏基因组学（gut metagenomics）利用分子生物学研究方法，借助高通量测序并结合生物信息学方法绕过纯培养技术研究肠道微生物多样性及功能，发掘微生物多样性结构和功能基因组、寻找新基因及其产物[34]。

中药进入消化道后主要存在以下几种情况：以原型形式被宿主直接吸收；经肠道细菌和/或内源性酶生物转化后以代谢物形式吸收；调节肠内微生态结构；作为废物随粪便直接排出体外[35]。不同类型细菌产生不同代谢酶，催化包括水解、还原、合成、杂环裂解和C葡萄糖苷CC裂解等不同的药物代谢反应，因此肠道菌群被视为药物肝脏代谢的补充或拮抗[36]。约60%的药物反应与肠道菌群相关：肠道菌群与宿主肝脏和免疫系统相互作用，通过直接生物转化或间接调节宿主药物吸收与代谢酶活性影响药物疗效与毒性（图3）[37]。中药大多数为口服药物，少则几十多则上千种的化学成分在进入体内后既有互相促进也会有拮抗作用，其在体内的药效活性成分既可能是原型成分也可能是代谢产物。通常认为，药物必须吸收入血，分布到靶器官，而且在相应的靶器官处在一定时间段内维持一定的浓度水平才可能发挥药效作用。然而很多中药成分难以被人体直接吸收，进入胃肠道与肠道菌群相互作用，进行生物转化或者调节肠道菌群结构与功能，从而影响甚至决定中药的疗效与毒性（图4）[38]。

因此，Nicholson等人提出“系统生物学”（global systems biology）概念，将肠道菌群的代谢作用纳入宿主整体代谢系统，视宿主、肠道菌群和其他环境因素为一个整体，通过基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学方法等来阐明药物或其他异源性物质在体内的代谢过程[41]，发现能够反映宿主遗传、代谢和环境因素变化的生物信息（标记物）谱系（bioinformatics profile）对患者分类并为其提供个性医疗服务。

肠道菌群作为“内化”了的环境因素，提供人体本身不具备的酶和生化代谢途径，催化包括中药在内的异源生物质体内代谢反应，因此肠道菌群被视为药物肝脏代谢的重要补充或拮抗，而人体全身的整体代谢，包括药物代谢实际上是其体内自身的基因组和其肠道内共生的微生物组活动的整合[42]。一方面，肠道菌群可以作为天然的生物转化器，影响中药疗效的发挥与毒性的改变。黄芩、葛根和豆豉中所含的黄芩苷、葛根素、异黄酮苷普遍存在于中药方剂和营养品中，体外研究表明，葛根素和异黄酮苷能被肠道菌群代谢为比前体物更加有效的大豆黄素和毛蕊异黄酮[43]。黄芩苷在肠道内难以被直接吸收，只有被肠道菌群水解为黄芩素后才能被吸收入血液而发挥作用，而口服黄芩苷的无菌小鼠与常规小鼠相比，肠道内的黄芩苷则几乎没有被代谢[44]。人参的主要活性成分人参皂苷存在类似的情况，在体外实验中人参皂苷的原始成分的生物活性很低，在血浆中的浓度未能达到药效浓度[45]；其在肝脏内基本不被代谢，主要是在肠道菌群的作用下降解。研究表明，肠道中的双歧杆菌、拟杆菌、梭菌等能够代谢人参皂苷[46]。另一方面，肠道菌群还可以作为中医药的作用靶点，实现中医药对机体多靶点的治疗作用[42]。含有多糖成分的补益类中药对益生微生物和致病微生物均具有扶植效应，但对益生微生物的扶植效果明显优于致病微生物。因此，长势良好的益生微生物所产的代谢产物又间接抑制了致病微生物的生长[47]。例如，党参多糖在体外可促进双歧杆菌的生长，从而增加乙酸的代谢，增强双歧杆菌的定植抗力[48]。用党参、茯苓、白术等补气类中药制成的复方合剂灌服小鼠发现，与灌服前比较，乳杆菌、双歧杆菌数量明显增加，肠球菌数量明显减少[49]。此外中药含有的黄酮类、萜类、蒽醌类、生物碱类、甾体类等生物活性成分，以及蛋白质、维生素等多种营养成分，对肠道微生态系统的平衡有很好的保护作用，能直接或间接地调节肠道菌群失调。

作为了解微生物群落结构组成与代谢功能金标准的测序技术，在近几年来，二代高通量测序技术（如454焦磷酸测序和illumina测序）朝着快速、高通量、低成本方向迅速发展，同时也促进了宏基因组学的研究。宏基因组（metagenome）是指一个微生物群落内所有成员的基因组的总和[50]。宏基因组学是一种不需要分离培养微生物而直接发现和利用其基因的新的技术策略，能够更加全面而深入的解析微生物群落的结构和组成，挖掘更多未知的功能基因和功能菌。研究策略上，全微生物组关联分析（microbiomewide association study， MiWAS）通过对肠道菌群结构的变化与中药体内代谢/生理病理指征的变化进行全局性相关性分析。MiWAS策略已广泛应用于解析肠道菌群在代谢性疾病，如肥胖、2型糖尿病等中的作用研究[51]，在菌群参与中药有效成分体内生物转化和代谢活性方面将是有益的借鉴。肠道菌群的结构变化用二代高通量测序技术对进化标记16S rRNA基因进行测序或者全微生物组的测序（宏基因组）来测量。中药体内代谢指征的变化以血液/尿液原型和代谢物含量、体外代谢活性和代谢酶活等来表征，辅以疾病相关生理指标。多元统计学方法（主成分分析PCA、冗余分析RDA、偏最小二乘法判别分析PLSDA和UniFrac等）以对肠道菌群种类组成、功能基因/通路组成和中药体内代谢的变化进行关联分析。

下列案例将从中药口服进入体内后与肠道菌群相互作用，即肠道菌群参与中药体内代谢和中药成分对菌群结构与功能调节方面展开论述。

2.1 肠道菌群代谢增强人参皂苷体内吸收 人参皂苷具有提高免疫力、抗肿瘤、抗疲劳、抗衰老、降血糖和保护心血管/中枢神经系统等药理作用。然而，人参皂苷口服后其原型药在肠道中的吸收程度低，如人参皂苷Rb1的吸收率仅约为1.0%，Rb2为3.4%，Rg1为1.9%，血药浓度难以达到充分发挥药理活性所需浓度[52]。口服生物利用度低的问题同样广泛存在于其他皂苷类、黄酮类（如大豆黄酮）、异黄酮类（如葛根素）、生物碱类（如小檗碱）和单萜类（如芍药苷）等中药有效成分中，成为制约相关中药制剂发展和临床应用的瓶颈问题[53]。作为“天然活性前体”的人参皂苷在肠道菌群分泌的各类糖苷酶（如β葡萄糖苷酶、α阿拉伯糖苷酶等）作用下逐级水解脱去糖基，转化成为药理作用更强的少糖基皂苷或苷元后吸收率大大增加，且体内分布广泛，在肝脏被酯化后发挥更长久、强劲的药效[54]。目前，人参皂苷Rbl的代谢途径研究较为清楚，即在C20，C3和C3位顺次水解1分子葡萄糖，依次生成人参皂苷Rd、人参皂苷F2，最终形成人参皂苷化合物K（compound K， CK），该化合物也是其他原人参二醇型皂苷在肠道内的主要代谢产物[45]。体外实验证实该过程由肠道细菌分泌的βD葡萄糖苷酶阶梯式地断开糖苷连接完成，Prevotella oris，Eubacterium A44，Bifidobacterium K506，Bacteroides JY6和Fusobacterium K60等肠道微生物协同参与了人参皂苷Rb1的代谢[55]。通过连续过度疲劳和急性冷应激（suffering successive overfatigue and acute cold stress， OACS）建立肠道菌群失调Qi缺陷型的小鼠模型，Zhou等[56]研究了人参多糖对人参皂苷肠代谢和吸收的影响，以及肠道菌群作为中介的作用机制。

HPGPC发现人参多糖具有1.00～1 308.98 kDa的相对分子质量分布，并鉴定出11种主要的皂苷成分，包括人参皂苷Re，Rg1，Rf，Rb1，20（S）Rg2，Rc，Rb2，Rd，F2，20（S）Rg3和CK等。结果表明，人参多糖可有效调节色氨酸、苯丙氨酸、溶血卵磷脂、胆酸、硫酸甲酚、氧化三甲胺（TMAO）、异柠檬酸和4甲基苯酚等内源性代谢物，改善OACS诱导的内源性代谢失调。对肠道菌群结构的影响，主要表现为在门水平上逆转OACS导致的菌群失调，增加厚壁菌门和减少拟杆菌门相对丰度。PCoA结果进一步证实：人参多糖，低聚果糖和空白组的聚集相互交织在一起，但模型组与之分离；与模型组相比，给予人参多糖或低聚果糖的小鼠体内拟杆菌属和乳杆菌属丰度增加（具有明显差异P<0.05或接近明显差异0.05

独参汤中的多糖成分使失衡的肠道菌群得以恢复，菌群的作用促进汤剂中人参皂苷的溶出与吸收。中药中的多糖成分一直以来被轻视甚至被忽视，现代工业化的中药制剂生产中将多糖作为杂质去除以达到符合要求的纯度；对中药汤剂的科学研究中也把多糖从主要的化学成分中排除。该研究有助于改变这种偏离传统中药的使用方法，也缺乏科学证据的做法，通过研究多糖和药效成分的协同作用，为中药汤剂的科学化和合理化使用提供指导。

2.2 肠道菌群介导灵芝提取物的减重效应 在我国，灵芝的使用已有2 000多年的历史，大量药理研究表明，灵芝具有调节免疫、保肝、抗肿瘤、抗衰老、提高机体耐缺氧能力等活性[57]。灵芝的化学成分复杂，从该属真菌中已分离得到灵芝多糖、三萜类化合物、核苷、氨基酸、甾醇、生物碱等多种成分。其中灵芝多糖和三萜类化合物可抑制糖尿病小鼠的脂肪细胞分化及降低血糖[58]；而蛋白聚糖则表现出抗血脂、抗氧化等活性[59]。血糖血脂代谢紊乱的核心，即肥胖已经逐渐成为全球性的公共健康问题，促进包括糖尿病，心血管疾病，高血压和癌症等并发症的发生。研究已经证明肥胖的发生常伴随慢性低度炎症以及肠道菌群生态紊乱，因此如何改善炎症，恢复肠道生态平衡成为肥胖研究的重要课题。

Chang等[60]向高脂饮食饲养诱导的肥胖小鼠食物中添加灵芝的水提取物（WEGL），发现肥胖小鼠表现出体重下降/脂肪积累减少（体重、附睾脂肪垫和皮下脂肪垫），炎症改善（TNFα，IL1β，IL6，IL10和PAI1），胰岛素敏感性增加等获益表型。PCoA分析和聚类分析表明高脂饮食和WEGL分别显著改变了健康/肥胖小鼠的菌群结构，WEGL降低由高脂肪饮食诱导的厚壁菌门/拟杆菌门（Firmicutes/Bacteroidetes）的比例升高以及产内毒素的蛋白菌（Proteobacteria）水平。而且通过恢复紧密连接蛋白ZO1和Occludin的表达，并保持肠屏障的完整性，进一步研究发现WEGL降低肥胖小鼠血清内毒素水平及Toll样受体4（TLR4）介导的内毒素体内信号通路，最终减少内毒素血症发生；同时还观察到，将处理过的小鼠粪便移植给其他肥胖的小鼠，可重现由WEGL所造成的减重等有益代谢效应。进一步地，从WEGL分离纯化得到大分子多糖物质（相对分子质量>300），同样表现出抗肥胖以及肠道菌群结构调节作用。

综上，这项研究首次发现灵芝及灵芝多糖具有降低体重和调节肠道生态平衡的作用，可作为预防菌群失衡和肥胖相关的代谢失调的益生元加以应用，同时表明灵芝补品对于肥胖和相关疾病的潜在治疗作用，但还需要深入研究其作用机制并进一步证明在人身上是否也有类似效应。同上一个案例相似地，中药中的多糖成分，人参多糖和灵芝多糖，都表现出对肠道菌群结构平衡的促进以及对相关症状的改善作用。

2.3 肠道菌群参与葛根芩连汤治疗2型糖尿病 肠道菌群通过调节宿主脂肪代谢和诱发代谢性内毒素血症引起慢性炎症等机制参与宿主肥胖、胰岛素抵抗等代谢性疾病的发生、发展[61]。以中心性肥胖和胰岛素抵抗为核心的代谢综合征是2型糖尿病（T2DM）、心脑血管疾病和动脉粥样硬化等的高危因素[62]。中药复方葛根芩连汤（GQD）出自张仲景的《伤寒论》，由葛根、黄芩、黄连和甘草等组成，是含有小檗碱，并长期用于治疗急性肠炎、细菌性痢疾和肠伤寒等的经典方剂。近年的动物实验或临床观察研究表明，GQD具有显著的降糖、降血脂的效果，在2型糖尿病等代谢性疾病的治疗上具有巨大的应用潜力。但是，已有的研究都是动物实验或者是开放、无安慰剂对照、样本量较小的临床观察，而且GQD的降糖机制目前也并不清楚。研究表明GQD在改善糖尿病大鼠血糖、血脂代谢的同时，显著调节了肠道菌群产生的代谢物。但是，究竟GQD能否调节肠道菌群，以及菌群是否参与了GQD的降糖作用等问题仍有待回答。

Xu等[63]基于随机、双盲与安慰剂对照等临床试验规范，将187例T2DM患者随机分为4组，分别接受高（N=44）、中（N=52）、低剂量（N=50）GQD和安慰剂（N=41）治疗12周，并对治疗前后患者粪便样品中细菌的DNA进行基于16S rRNA基因可变区V3区的454焦磷酸测序和多元统计分析。结果表明，安慰剂组和低剂量GQD治疗组患者临床症状未显著改善，Unweighted Unifrac PCoA和MANOVA分析结果相互印证，表明菌群结构也未发生明显变化。随着GQD剂量的提高，患者治疗后的菌群结构与治疗前的差异不断增加，即菌群结构样本点偏离得越远；T2DM诊断指标空腹血糖（FBG）和糖化血红蛋白（HbAlc）改善也更显著，表现出明显的剂量效应。此外，用药4周后高剂量组患者的菌群已显著不同于用药前，并在此后的8周维持不变，但是血糖水平一直持续改善。冗余分析（RDA）从4 000多种肠道细菌中找到了146种响应GQD治疗的细菌种类，其中47个OTU被显著富集，且17个OTU与FBG显著负相关，9个OTU与HbA1c显著负相关。特别是产丁酸盐的Faecalibacterium prausnitzii，高通量测序及定量PCR结果都证实其丰度变化与T2DM症状指标（FBG，HbAlc和2hPBG等）改善显著负相关，与HOMAβ显著正相关。

研究表明，中药复方GQD可以有效地调节肠道菌群结构，特别是增加有益菌如Faecalibacterium spp.等的含量，且菌群改变与血糖代谢改善显著相关，提示肠道菌群可能参与了GQD降糖作用，也提示中药可作为以肠道菌群为靶点治疗T2DM的新药来源。该研究首次在人群试验中观察了GQD在治疗T2DM过程中患者肠道菌群的变化及其与糖尿病改善的关系，也表明严格质量控制的复方中药也可以做RCT试验验证其疗效，而且基于宏基因组学的肠道菌群结构变化监测为理解中药的作用机制提供了新的途径。

3 研究方法

由于中药的复杂性，多种交叉学科技术被引入到中药体内代谢研究。基于从单一化合物到复杂体系的代谢研究思路与策略，对中药体内代谢的生化过程以及代谢物本身的研究，化学半合成及生物催化合成用于代谢产物的制备；体外代谢模型能更好地对不同组分的体内处置进行模拟并给出解释，常用的体外模型如细胞水平的Caco2模型、血脑屏障模型、酶水平的P450酶系、UGT/SULT酶系。此外，动物或人群试验，以及基于血清中含有的成分才是中药的体内直接作用物质的学说而建立的血清药物化学，是研究中药体内代谢过程的有效方法。

在上述体内外模型基础上开展的中药体内代谢基因组研究，本质上同样基于基因组学技术，主要为微阵列芯片技术和测序技术。以基因芯片为代表的微阵列芯片是研究分析基因的一种强有力的分子生物学技术，是进行中药基因组研究的主要工具。在基因芯片的表面，以微阵列的方式固定大量并行的寡核苷酸或cDNA探针，对生物体整个基因组的基因表达进行测定。基因芯片以高通量、多因素、微型化和快速灵敏的特点而见长，能够针对中药的多成分、多途径、多系统、多靶点的作用特点而进行系统深入的研究。

除常规的微生物分子生态学技术，包括细菌16S rRNA基因克隆文库技术、PCRDGGE/TGGE和TRFLP等DNA指纹图谱技术外，近年来迅猛发展的454，illumina等二代高通量测序技术使得对肠道宏基因组的高通量、大规模深度测序成为可能，极大促进了肠道宏基因组学的发展。同时结合多变量统计方法，如主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLSDA）等，可直接地获得肠道微生物的组成和功能信息，鉴定出与中药体内代谢密切相关的特定的细菌类群和生物转化基因功能，从而为中药体内代谢研究提供更多的信息[34]。

综上，中药基因组学和肠道宏基因组学从不同角度对中药体内代谢进行研究，但从药物研究和毒理学评价层面来看，基因组学研究的是生物体受外源性物质刺激后基因表达的改变，而基因表达调控与系统的整体功能之间的关系并不清楚。中药作用于人体，一方面自身会被肝药酶或肠道菌群代谢，产生活化或者失活的代谢产物；另一方面中药及其代谢产物会导致机体内源性物质应答的变化，引起全身水平复杂的代谢网络变化，体现在体液内/外源性代谢物的成分构成或相对浓度的变化，从而提供了药物作用机制和作用靶点的信息[34]。随着色谱质谱联用仪法、核磁共振波谱法、色谱核磁质谱联用等分析技术的发展，代谢产物鉴定及多成分药代动力学研究已有较成熟的平台。代谢组学（metabonomics）表征生物体整体功能状态的特点，与中药的“多组分、多靶点、整体调节，协同作用”的特点相吻合，因此是研究系列中药现代化关键科学问题的重要手段。张旭等[34]认为综合运用中药基因组学、肠道宏基因组学、代谢组学以及生物信息学等技术对中药体内代谢进行系统而深入的研究，有望为中药现代化研究打开新局面。

[参考文献]

[1] 韩旭华， 牛欣，杨学智.方剂药效物质系统与单味药成分之间的非线性关系[J].中华中医药杂志， 2006， 21（5）：289.

[2] 张昱，谢雁鸣.后基因组时代中医药研究思路方法新探[J].中医药学刊， 2001， 19（5）：426.

[3] Lederberg J. Infectious history[J].Science， 2000， 288（5464）：287.

[4] Spor A， Koren O，Ley R. Unravelling the effects of the environment and host genotype on the gut microbiome[J]. Nat Rev Microbiol， 2011， 9（4）：279.

[5] Qin J， Li R， Raes J， et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing[J]. Nature， 2010， 464（7285）：59.

[6] 王升启.试论“中药化学组学”与“中药基因组学”[J].世界科学技术——中医药现代化， 2000， 2（1）：19.

[7] 陈士林， 朱孝轩， 李春芳， 等. 中药基因组学与合成生物学[J].药学学报， 2012（8）：1070.

[8] 陈士林，宋经元.本草基因组学[J].中国中药杂志，2016，41（21）：3381.

[9] Weinshilboum R. Pharmacogenomics——drug disposition， drug targets， and side effects[J]. New Engl J Med， 2004， 348（6）：538.

[10] 荆志伟， 王忠， 高思华， 等. 基因芯片技术与中药研究——中药基因组学[J].中国中药杂志， 2007， 32（4）：289.

[11] Lee S M Y， Li M L Y， Yu C T， et al. Paeoniae Radix， a Chinese herbal extract， inhibit hepatoma cells growth by inducing apoptosis in a p53 independent pathway[J]. Life Sci， 2002， 71（19）：2267.

[12] Watanabe C M， Wolffram S， Ader P， et al. The in vivo neuromodulatory effects of the herbal medicine Ginkgo biloba[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2001， 98（12）：6577.

[13] Zhang Z J， Wang Z， Zhang X， et al. Gene expression profile induced by oral administration of baicalin and gardenin after focal brain ischemia in rats[J]. Acta Pharmacol Sin， 2005， 26（3）：307.

[14] Zhang Z， Li P， Wang Z， et al. A comparative study on the individual and combined effects of baicalin and jasminoidin on focal cerebral ischemiareperfusion injury[J]. Brain Res， 2007， 1123（1）：188.

[15] 张立平， 马建文，张洪亮.六味地黄颗粒对晚期肝肾阴虚型结直肠癌患者基因表达谱的差异分析[J].实用临床医药杂志， 2014， 18（17）：52.

[16] 高利臣， 张伟， 刘昭前， 等. 药物代谢相关基因介导的中草药药物相互作用研究[J].中国临床药理学与治疗学， 2012， 17（3）：346.

[17] Wang L， Zhou G， Zhu B， et al. St John′s wort induces both cytochrome P450 3A4catalyzed sulfoxidation and 2C19dependent hydroxylation of omeprazole[J]. Clin Pharmacol Ther， 2004， 75（3）：191.

[18] Efferth T， Fu Y J， Zu Y G， et al. Molecular targetguided tumor therapy with natural products derived from traditional Chinese medicine[J]. Curr Med Chem， 2007， 14（19）：2024.

[19] Kelter G， Steinbach D， Konkimalla V B， et al. Role of transferrin receptor and the ABC transporters ABCB6 and ABCB7 for resistance and differentiation of tumor cells towards artesunate[J]. PLoS ONE， 2007， 2（8）：1080.

[20] Sertel S， Eichhorn T， Simon C H， et al. Pharmacogenomic identification of cMyc/Maxregulated genes associated with cytotoxicity of artesunate towards human colon， ovarian and lung cancer cell lines[J]. Molecules， 2010， 15（4）：2886.

[21] Scherf U， Ross D T， Waltham M， et al. A gene expression database for the molecular pharmacology of cancer[J]. Nat Genet， 2000， 24（3）：236.

[22] Wang C， Dai Y， Yang J， et al. Treatment with total alkaloids from Radix Linderae reduces inflammation and joint destruction in type Ⅱ collageninduced model for rheumatoid arthritis[J]. J Ethnopharmacol， 2007， 111（2）：322.

[23] Kim E K， Kwon K B， Shin B C， et al. Scopoletin induces apoptosis in human promyeloleukemic cells， accompanied by activations of nuclear factor κB and caspase3[J]. Life Sci， 2005， 77（7）：824.

[24] Seo E J， Saeed M， Law B Y， et al. Pharmacogenomics of scopoletin in tumor cells[J]. Molecules， 2016， 21（4）：496.

[25] Ward C P， Redd K， Williams B M， et al. Ginkgo biloba extract[J]. Pharmacol Biochem Behav， 2002， 72（4）：913.

[26] Zuo X C， Zhang B K， Jia S J， et al. Effects of Ginkgo biloba extracts on diazepam metabolism：a pharmacokinetic study in healthy Chinese male subjects[J]. Eur J Clin Pharmacol， 2010， 66（5）：503.

[27] Yin O Q， Tomlinson B， Waye M M， et al. Pharmacogenetics and herbdrug interactions：experience with Ginkgo biloba and omeprazole[J]. Pharmacogenetics， 2004， 14（12）：841.

[28] 徐凯进， 李兰娟，邢卉春.肠道菌群参与宿主代谢对医疗个性化的影响[J].国际流行病学传染病学杂志， 2006， 33（2）：86.

[29] Kochhar S， Jacobs D M， Ramadan Z， et al. Probing genderspecific metabolism differences in humans by nuclear magnetic resonancebased metabonomics[J]. Anal Biochem， 2006， 352（2）：274.

[30] Holmes E，Nicholson J K. Variation in gut microbiota strongly influences individual rodent phenotypes[J]. Toxicol Sci， 2005， 87（1）：1.

[31] Schnackenberg L K. Global metabolic profiling and its role in systems biology to advance personalized medicine in the 21st century[J]. Expert Rev Mol Diagn， 2007， 7（3）：247.

[32] Ley R E， Lozupone C A， Hamady M， et al. Worlds within worlds：evolution of the vertebrate gut microbiota[J]. Nat Rev Microbiol， 2008， 6（10）：776.

[33] Eckburg P B， Bik E M， Bernstein C N， et al. Diversity of the human intestinal microbial flora[J]. Science， 2005， 308（5728）：1635.

[34] 张旭， 赵宇峰， 胡义扬， 等. 基于功能元基因组学的人体系统生物学新方法：中医药现代化的契机[J].世界科学技术——中医药现代化， 2011， 13（2）：202.

[35] 杨秀伟，徐嵬.中药化学成分的人肠内细菌生物转化模型和标准操作规程的建立[J].中国中药杂志， 2011， 36（1）：19.

[36] 杨秀伟.中药成分代谢分析[M]. 北京：中国医药科技出版社， 2003.

[37] Lhoste E F， Ouriet V， Bruel S， et al. The human colonic microflora influences the alterations of xenobioticmetabolizing enzymes by catechins in male F344 rats[J]. Food Chem Toxicol， 2003， 41（5）：695.

[38] Li H， Zhou M， Zhao A， et al. Traditional Chinese medicine：balancing the gut ecosystem[J]. Phytother Res， 2009， 23（9）：1332.

[39] Nicholson J K， Holmes E， Lindon J C， et al. The challenges of modeling mammalian biocomplexity[J]. Nat Biotechnol， 2004， 22（10）：1268.

[40] Haiser H J，Turnbaugh P J. Is it time for a metagenomic basis of therapeutics？[J]. Science， 2012， 336（6086）：1253.

[41] Nicholson J K，D Wilson I. Understanding ′global′ systems biology：metabonomics and the continuum of metabolism[J]. Nat Rev Drug Discov， 2003， 2（8）：668.

[42] Jia W， Li H， Zhao L， et al. Gut microbiota：a potential new territory for drug targeting[J]. Nat Rev Drug Discov， 2008， 7（2）：123.

[43] Kim D H， Yu K U， Bae E A， et al. Metabolism of puerarin and daidzin by human intestinal bacteria and their relation to in vitro cytotoxicity[J]. Biol Pharm Bull， 1998， 21（6）：628.

[44] Akao T， Kawabata K， Yanagisawa E， et al. Balicalin， the predominant flavone glucuronide of Scutellariae Radix， is absorbed from the rat gastrointestinal tract as the aglycone and restored to its original form[J]. J Pharm Pharmacol， 2000， 52（12）：1563.

[45] Wang H， Qi L， Wang C， et al. Bioactivity enhancement of herbal supplements by intestinal microbiota focusing on ginsenosides[J]. Am J Chin Med， 2012， 39（6）：1103.

[46] Bae E A， Han M J， Kim E J， et al. Transformation of ginseng saponins to ginsenoside rh 2 by acids and human intestinal bacteria and biological activities of their transformants[J]. Arch Pharm Res， 2004， 27（1）：61.

[47] 徐永杰， 张波，张祎腾.牛蒡多糖的提取及对小鼠肠道菌群的调节作用[J].食品科学， 2009， 30（23）：428.

[48] 王广， 马淑霞， 胡新俊， 等. 党参多糖对双歧杆菌和大肠埃希菌体外生长的影响[J].中国微生态学杂志， 2010， 22（3）：199.

[49] 陈琛， 江振友， 宋克玉， 等. 中草药对小鼠肠道菌群影响的实验研究[J].中国微生态学杂志， 2011， 23（1）：15.

[50] Handelsman J. Metagenomics：application of genomics to uncultured microorganisms[J]. Microbiol Mol Biol Rev， 2004， 68（4）：669.

[51] Raes J. The gut microbiome——a new target for understanding， diagnosing and treating disease[J]. Arch Public Health， 2014， 72（S1）：1.

[52] 李文兰， 南莉莉， 季宇彬， 等. 人参中人参皂苷Rg1，Rb1在体肠吸收影响因素的研究[J].中国中药杂志， 2009， 34（20）：2627.

[53] Gao S， Basu S， Yang G， et al. Oral bioavailability challenges of natural products used in cancer chemoprevention[J]. Prog Chem， 2013（9）：1553.

[54] Hasegawa H. Proof of the mysterious efficacy of ginseng：basic and clinical trials：metabolic activation of ginsenoside：deglycosylation by intestinal bacteria and esterification with fatty acid[J]. Jap J Pharmacol， 2004， 95（2）：153.

[55] Kim D H. Metabolism of ginsenosides to bioactive compounds by intestinal microflora and its industrial application[J]. J Gins Res， 2009， 33（3）：165.

[56] Zhou S， Xu J， Zhu H， et al. Gut microbiotainvolved mechanisms in enhancing systemic exposure of ginsenosides by coexisting polysaccharides in ginseng decoction[J]. Sci Rep， 2016， 6：22474.

[57] 张晓云，杨春清.灵芝的化学成分和药理作用[J].现代药物与临床， 2006， 21（4）：152.

[58] Li F， Zhang Y， Zhong Z. Antihyperglycemic effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on streptozotocininduced diabetic mice[J]. Int J Mol Sci， 2011， 12（9）：6135.

[59] Pan D， Zhang D， Wu J， et al. Antidiabetic， antihyperlipidemic and antioxidant activities of a novel proteoglycan from Ganoderma lucidum fruiting bodies on db/db mice and the possible mechanism[J]. PLoS ONE， 2013， 8（7）：e68332.

[60] Chang C J， Lin C S， Lu C C， et al. Ganoderma lucidum reduces obesity in mice by modulating the composition of the gut microbiota[J]. Nat Commun， 2015， 6：7489.

[61] Clemente J C， Ursell L K， Parfrey L W， et al. The impact of the gut microbiota on human health：an integrative view[J]. Cell， 2012， 148（6）：1258.

[62] Grundy S M. Atlas of atherosclerosis and metabolic syndrome[M]. New York：SpringerVerlag， 2011.

[63] Xu J， Lian F， Zhao L， et al. Structural modulation of gut microbiota during alleviation of type 2 diabetes with a Chinese herbal formula[J]. ISME J， 2015， 9（3）：552.

[责任编辑 孔晶晶]