张 韵，赵丽娜，曹 琳，王晓彤，周馨魁，古绍彬

（河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳 47102）

益生凝结芽孢杆菌的筛选及生物学特性研究

张 韵，赵丽娜，曹 琳，王晓彤，周馨魁，古绍彬*

（河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳 47102）

本实验依据益生菌筛选的常规方法和凝结芽孢杆菌的判定标准，旨在从健康仔猪粪便中分离获得益生性能优良且安全的益生凝结芽孢杆菌，并通过体外模拟动物肠道环境，评价其益生特性和应用特点。本研究从70余株猪源芽孢杆菌中筛选鉴定出4株凝结芽孢杆菌，分别命名为BC147、BC235、BC303和 BC310。结果表明：4株菌对大肠杆菌K88，鸡肠炎沙门菌，猪肠炎沙门菌，金黄色葡萄球菌，鼠伤寒沙门菌均表现出良好的抑菌作用。益生及耐受性研究发现，四株菌均具有良好黏附能力，并对胆盐和低酸环境表现出较强的耐受能力，其中BC303 对仔猪肠黏液的黏附率高达41.67%，在pH 4的条件下其营养细胞存活率高达91.0%，在0.3%胆盐中暴露2 h，其存活率仍然维持在40%以上。同时，四株菌均具有一定的蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶产生能力。结果显示，从健康仔猪肠道及粪便分离筛选获得的凝结芽孢杆菌具有良好的益生性和安全性，其在畜禽养殖中具有广泛应用前景。

凝结芽孢杆菌；体外抑菌实验；黏附性；水解酶活性

凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），为同型乳酸发酵菌，是最具潜力的益生菌之一，近年来受到国内外学者广泛关注[1]。由于该菌可产生多种代谢物，如抑菌物质：LA、lactospore、细菌素和凝固素等；消化酶类：α-淀粉酶、纤维素酶、β-半乳糖苷酶、脂肪酶和蛋白酶等，还可促进动物机体对某些矿物质元素（如铁、磷、钙和锌等） 和维生素D的吸收利用，从而表现出良好的益生性能。研究表明凝结芽孢杆菌除了在维持肠道微生态平衡中的保健作用外，其对常见肠道疾病如慢性结肠炎、腹泻和便秘等有明显疗效，还具有调节血糖血脂和捉高免疫力的功效。由于其兼具乳酸菌和芽孢菌共同的特点，以及良好的安全性，1989年被美国FDA 认可其为 “普遍认为安全（GRAS）” 的杆菌，此外还获得了欧洲欧盟食品安全局（EFSA）的安全资格认定（QPS），至今仍被评定为缺乏产毒潜能[2-3]。目前，该菌在美国、欧洲等地除被应用于临床和食品添加外，还被推荐作为可直接饲喂微生物用于畜牧业生产[4-5]。我国目前使用的凝结芽孢杆菌多为外籍菌，且益生菌从生产到进入动物肠道发挥作用，需经历热、高压以及胃酸和胆汁等不利因素的影响。因此，从禽畜肠道获得具有较好黏附和定植特征的天然菌种，可有效确保菌种良好的益生性能和安全性。

1 材料与方法

1.1 样品采集 粪便样品采集自洛阳龙门裴村养猪场15～40日龄健康仔猪粪便；肠黏液采集自该养猪场健康仔猪盲肠及大肠。

1.2 测试用病源菌株 大大肠杆菌K88（E. coliK88），鸡肠炎沙门菌（Salmonella enteritidis）O:1,9,12猪肠炎沙门菌（Salmonella enteritidis ）O4Hi，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 29213，鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium) ATCC 13311, 以上菌株由河南科技大学食品与生物工程学院牛明福老师和张敏老师惠赠。

1.3 培养基 LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0、酵母提取物5.0、NaCl 10.0, pH 7.0～7.2, 配制固体培养基时需添加20 g琼脂。

碳酸钙鉴定平板（g/L）：牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0、碳酸钙 1.0、琼脂 2.0、pH 7.0～7.2。淀粉培养基（g/L）：可溶性淀粉2.0、胰蛋白胨10.0、牛肉膏5.0、NaCl 5.0、琼脂20.0、pH 7.0～7.2。纤维素酶选择性培养基（g/L）：羧甲基纤维素钠20.0、胰蛋白胨 2.5、Na2HPO42.5、KH2PO41.5、琼脂 20.0、pH 7.0～7.2。蛋白酶选择性培养基（g/L）：干酪素 5.0、葡萄糖 10.0、酵母粉 10.0、K2HPO41.0、，KH2PO40.5、MgSO40.1、琼脂 20.0、pH 7.0～7.2。

1.4 芽孢杆菌的分离筛选 对凝结芽孢杆菌的分离采用热处理、产酸鉴定和接触酶阳性鉴定法。称取1 g样品于9 mL无菌生理盐水中，充分混匀，80℃水浴温育30 min后，按照3%的接种量接种于LB培养基中，37℃培养24 h；然后，取菌液依次稀释至10-6，100 μL涂布于碳酸钙鉴定平板；挑取产生溶钙圈及生长良好的单菌落进行革兰染色、芽孢染色和接触酶实验，选取革兰氏阳性、产芽孢且接触酶为阳性的杆状细菌作为候选芽孢杆菌，继续纯化培养，保藏备用。

1.5 生理生化实验 生理生化鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》进行葡萄糖产酸产气实验、V-P实验、淀粉酶水解实验、明胶液化实验、吲哚实验、运动性实验、卵黄卵磷脂酶实验和络氨酸分解实验等[6-7]。

1.6 16SrDNA 分子生物学鉴定 引物设计：P0：（5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG - 3′）；PC3：（5′- CTAHAGGGTATCTAATCCT- 3′）；由生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成。

基因组DNA的提取：细菌DNA的提取采用索莱宝公司细菌DNA提取试剂盒。

16SrDNA的扩增与测序：以上述提取的DNA作为模板，以16SrDNA引物P0，PC3为引物进行PCR扩增。 PCR扩增体系（25 μL）：ddH2O：9.5 μL；上游引物：1μL，下游引物：1 μL，模板DNA：1 μL，PCR Mix：12.5 μL，PCR反应程序：94℃预变性 5 min，94℃变性 1.5 min，55℃退火1 min，72℃延伸 1.5 min，72℃最终延伸 10 min。

对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，将测得的基因序列提交到NCBI数据库做BLAST比对，进行序列同源性分析。

1.7 黏附性实验 将候选益生凝结芽孢杆菌接种于LB培养基中，37℃恒温震荡培养24 h，然后离心（5 000 r/ min，10 min）收集菌体，用无菌PBS洗涤2次后重悬，调整细菌浓度为108CFU/mL。刮取健康仔猪的肠黏液于无菌PBS中，震荡后2 000 r/ min离心15 min，收集上清液并调整蛋白含量为0.5 mg/mL，-20℃保藏待用。取300 μL肠黏液于96孔细胞培养板中，4℃过夜；无菌PBS洗涤2次，加入300 μL的已制备好的菌悬液，37℃孵育2h；PBS洗涤2次，加入1%SDS 0.1 mol/L NaOH（300 μL/孔），60℃孵育1 h；最后，使用血球计数板进行计数。黏附百分率为黏附前后细菌个数之比乘以100%[13-14]。

1.8 耐受性实验 将筛选到的凝结芽孢杆菌接种于LB培养基中并置37℃恒温条件下震荡培养24 h，离心（5 000 r/ min，10 min）收集菌体，菌体重悬于无菌PBS（pH=7）中洗涤1次后制备成菌悬液。耐酸实验：将菌悬液每1 mL分装离心后，分别加入pH为1.0、2.0、 3.0、4.0、5.0的10 mL PBS缓冲液中；耐胆盐实验：将菌悬液每1 mL分装离心后，分别加入到10 mL胆盐浓度为0.03%、0.1%、0.3%、0.5%及0.7%（w/v）的PBS缓冲液（pH=7）中。上述样品在37℃孵育2 h，涂平板计数。存活率（%）等于实验组与对照组活菌数之比乘以100%。

1.9 致病菌拮抗实验 验所用病原菌为畜禽肠道常见致病菌。菌株抑菌性的研究采用的方法是牛津杯法。在LB液体培养基中分别接种各类病原菌，37℃过夜培养，然后分别取1 mL病原菌菌液（标定为108CFU/mL）加入100 mL牛肉膏蛋白胨琼脂溶液中，充分混匀，倒入加有牛津杯的平板中，冷却后，取出牛津杯，将凝结芽孢杆菌的培养菌液（100 μL）经0.25 μL滤膜过滤后分别加入到平板上用牛津杯打出的直径为6 mm的孔中，37℃孵育24 h后，测量抑菌圈直径。

1.10 产酸活性及水解酶活性测试 水解酶活性的采用的方法是牛津杯法。将凝结芽孢杆菌接种于LB液体培养中并置37℃恒温条件下震荡培养24 h，吸取100 μL培养液分别加入淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶选择性平板上的牛津杯孔内。37℃培养24 h。然后在淀粉酶平板上滴加卢氏碘液（5 mmol/L I2、5 mmol/L KI），观察菌落周围是否出现水解圈；在纤维素酶平板，滴加1 mg/mL的刚果红溶液染色30 min，后滴加1 mol/L NaCl，观察菌落周围是否出现水解圈；蛋白酶活性可直接观察透明圈。

表1 4株候选益生芽孢杆菌生理生化及形态特征

2 结果与分析

2.1 芽孢杆菌的分离筛选及鉴定 本研究通过热处理、革兰染色、芽孢染色、接触酶实验和碳酸钙鉴定平板进行分离筛选，分离出76株芽孢杆菌，形态及染色观察发现BC147、BC235、BC310、BC303菌落呈圆形，除观察到BC147孢子为中生为，其他3株菌均为端生；生理生化鉴定发现，上述4株菌标准凝结芽孢杆菌的生理生化特征基本一致（结果见表1），初步鉴定为凝结芽孢杆菌。

为进一步确认4种菌的种属关系，通过细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取了BC147、BC235、BC310、BC303基因组的DNA，并以P0: 5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′ 和PC3: 5′-CTAHAGGGTATCTAATCCT-3′为PCR上下游引物，进行PCR 扩增，扩增出约750 bp 的特异条带并测序。序列结果与 GenBank （httP:// www.ncbi.nlm.nih.gov）中的16S rDNA 序列进行Blastn 相似性分析发现，4株菌株均与凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans） 的16S rDNA 序列的同源性达到了97%。采用EzTaxon在线比对进行有效物种的相似性搜索，然后采用MEGA 5.0 和 NJ算法构建出4株菌的系统发育树（图1），从进化距离分析发现BC147、BC235、BC310、BC303与Bacilluscoagulans IAM 12463标准模式菌株接近，这与生理生化鉴定结果一致，因此将它们鉴定为凝结芽孢杆菌。

表 2 4株凝结芽孢杆菌对常见肠道病原菌的拮抗作用

图1 BC147、BC235、BC310和BC303的16SrDNA基因序列的系统发育树

2.2 病原菌拮抗实验 对分离到的4株凝结芽孢杆菌进行常见畜禽肠道病原菌抑菌实验，结果见表2。4株菌对所测试的肠道常见病原菌大肠杆菌K88（E.coli K88），鸡肠炎沙门氏菌（S. enteritidis）O:1,9,12，猪肠炎沙门氏菌（S. enteritidis ）O4Hi，金黄色葡萄球菌（S. aureus）ATCC 29213和鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium） ATCC 13311均表现出拮抗作用，其中对鼠伤寒沙门氏菌拮抗效应最为明显。4株菌对同一病原菌间的抑菌效果差异不显著。

2.3 黏附性 益生菌进入肠道后，通过黏附在肠黏膜上抑制致病菌的定植，并与肠道黏膜细胞共同构成生物屏障，改善肠道微生态平衡，保护宿主抵御外来微生物的入侵[7]。图2显示，4株凝结芽孢杆菌对猪肠黏液均有不同程度的黏附性能，其中BC303对肠黏液的黏附能力最强，达41.67%±3.73%，良好的黏附性决定其更好的发挥其益生特性。

图2 实验菌株对肠黏液的黏附率（n=3）

图3 菌株对酸的耐受性（n=3）

图4 菌株对胆盐的耐受性（n=3）

2.4 耐酸及耐胆盐特性 动物肠胃道酸度为pH 2～3，小肠接近中性达到pH5～7，因此本研究中耐酸性实验的pH控制在1～5。凝结芽孢杆菌营养细胞在不同pH环境下暴露2 h后的存活率见图3所示。由图3可知，4株菌在pH 1～2的极端条件下暴露2 h后仍有15%以上的存活率，在pH 3时BC147耐受性急剧增加，存活率达到78.0%±5.8%；而BC303在pH4时其营养细胞存活率回复到了91%±3.5%。由此可见，分离获得的4株凝结凝结芽孢杆菌具有较强的耐酸受能力，在pH 3以上均能很好存活，当芽孢通过胃酸环境进入小肠后在pH5～7的小肠环境中可顺利萌发和增殖，为其益生特性的发挥奠定了重要基础。凝结芽孢杆菌胆盐耐受力如图4所示，在胆盐浓度为0.03%时，菌株均能良好生存，在胆盐浓度为0.1%和0.3%时，BC303的存活率达到了40%以上，而在胆盐浓度为0.5%时，BC235耐受率仍在45.3%±3.2%。因此BC235和BC303具有良好的耐胆盐能力。综合分析耐酸性和耐胆盐能力，BC303呈现出更好的耐受性，能更好地适应胃酸和肠道胆盐环境，更好地发挥其生物学特性。

2.5 胞外水解酶活性 淀粉、蛋白质和纤维素是动物饲料的主要成分，为提高饲料利用率，人们通常来受到国内外学者广泛关注[1]。由于其兼具乳酸菌和芽孢菌共同的特点，以及良好的安全性，1989年就被美国FDA 认可其为 “普遍认为安全（GRAS）”的杆菌，并被列入美国农业部GRAS和美国饲料控制委员会（AAFCO）名单中；同时其还被欧洲食品与饲料菌种协会（EFFCA）和国际乳品联合会（IDF）共同认定为GRAS菌种[2]，并获得了欧洲欧盟食品安全局（EFSA）的安全资格认定（QPS），且至今仍被评定为缺乏产毒潜能[3]。目前，该菌在美国、欧洲等地除被应用于临床和食品添加外，还被推荐将淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等饲用酶添加到饲料中，以补充动物体内内源酶的不足，从而提高饲料中营养成分的吸收率。近年来，随着益生菌在中国养殖行业的兴起，产酶益生菌兼具益生菌和饲用酶的特点受到越来越广泛的关注。BC147、BC235、BC310和BC303胞外水解酶特性如图5所示，经过夜培养在淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶选择性平板上呈现出明显的水解圈，4菌产纤产维素酶和蛋白酶能力明显强于产淀粉酶的能力。

图5 候选菌株在3种水解酶选择性培养基上的水解特性

3 讨 论

凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），属于硬（或厚）壁菌门，芽孢杆菌属，革兰氏阳性菌，为同型乳酸发酵菌；其作为最具潜力的益生菌之一，近年作为可直接饲喂微生物用作畜牧业生产[4-5]。在动物源食品药物残料超标日益严峻的形势下，新型益生菌的引入，对减少药物的使用，降低动物性食品源头污染具有极其重要的作用。从健康动物的粪便或肠道中分离筛选凝结芽孢杆菌菌株是保证菌株安全无毒的前提，同时也确保菌株在进入动物肠道后能够更好定植并生长繁殖。因此，动物源益生菌的筛选受到越来越广泛的关注。本文从黏附性、耐受性、抗菌性及产酸和产水解酶活性出发，对筛选到的4株候选益生芽孢杆菌益生特性进行研究。

益生菌对动物肠道的黏附能力是其发挥益生作用的重要标准。在大部分的实验研究中，对益生菌的黏附特性研究均采用体外细胞模型[8]，且黏附到肠道黏液则是其定植于肠道上皮细胞的先决条件，因此本研究采用的对仔猪肠黏液的黏附来表征和评价其黏附能力。Li等[9]筛选的乳酸菌Lactobacillus acidoPhilus I021、Lactobacillusgasseris1031和Lactobacillus reuteri I2021对仔猪肠道的黏附率分别达到了17.9%± 1.1%、9.8%± 1.1%、13.1%± 1.4%，并表现出良好的益生性能。而本研究筛选到的4株益生凝结芽孢杆菌均表现出更强的黏附性能，其中BC303对仔猪前肠黏液黏附率最高，达到41.67%±3.73%。在肠道黏膜上的高效定植能够与致病菌进行竞争性排斥，从而调整肠道微生物组成，维持肠道微生态平衡。

良好的耐受性也是益生菌发挥作用的基本条件，动物胃部酸度为pH 2～3。只有具有较高的耐受性才能使菌株在胃肠道内存活、生长并发挥益生特性。本研究筛选到的BC147在pH3时耐受率高达78.0%±5.8%，BC303在pH4的条件下耐受率高达91%±3.5%；在胆盐浓度为0.1%和0.3%时，BC303的耐受率为40%以上，而在胆盐浓度为0.5%时，BC235耐受率仍在45.3%±3.2%。营养细胞状态的候选益生凝结芽孢杆菌表现出高的耐受性能力，为其在胃酸环境及肠道环境下稳定存活，更好地发挥其益生特性奠定了基础。

凝结芽孢杆菌可以产生大量的代谢产物，如l-乳酸、凝固素和lactosPorin等，这些代谢产物可有效调整肠道菌群的结构，增加肠道正常微生物数量，消除来自外部环境的抗原，提高上皮细胞的生存力，构建完整的生物屏障系统，刺激抗体和抗炎细孢因子的分泌，加强对共生细菌的免疫反应，提高肠道黏膜免疫力，改善肠道微环境等。因此，抑菌特性及其产酸能力也是凝结芽孢杆菌益生特性的一项重要指标。通过对其抑菌特性研究发现，4株凝结芽孢杆菌均能对大肠杆菌K88（E.coli K88），鸡肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）O:1,9,12，猪肠炎沙门氏菌O4Hi，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 29213和鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium） ATCC 13311产生抑制作用。

众所周知，动物饲料的主要成分是淀粉、蛋白质、脂肪和纤维素等。为提高饲料的利用率，一般采用外加水解酶的形式来提高动物对饲料的吸收与利用。近年来，随着饲用益生菌在国内养殖行业的兴起，有关产酶益生菌的研究越来越受到广泛关注。与普通的饲用酶相比，产酶益生菌除本身具有的益生性外，还具有更酶制剂难以比拟的优点。首先产酶益生菌大部分是属于芽孢杆菌，由其制成的微生态产品，性能稳定，耐热性号，而普通的饲用酶多是微生物发酵产生，其制成的产品其耐热性能相对较差。其次，产酶益生菌进入肠道后生长繁殖，在肠道内，由于受到饲料中各成分（纤维素、半纤维素、淀粉、蛋白质、脂肪、果胶等）的诱导和刺激，能针对摄入的饲料成分产生相应的分解酶，提高消化酶的浓度和活性，增加饲料成分的消化作用位点。而在饲料中直接添加的酶制剂，包括近年兴起的组合酶（或复合酶）则均没有这一特性；因为酶制剂所含酶的种类固定，对饲料的消化没有机动性与针对性，且当其进入体内时还会被机体消化一部分。如果要提高酶制剂效果，必须针对性地增加酶的种类，并提高酶添加量，这必将导致成本增加；另一方面过度添加酶制剂将会抑制动物机体原有消化酶的分泌，长期使用将会引起动物消化机能下降。

[1] Jurenka J S. Bacillus coagulans: Monograph [J]. Altern Med Rev, 2012, 17(1):76-81.

[2] Mogensen G, Salminen S, O'Brien J, et al. Ⅰnventory of microorganisms with a documented history of use in food [E].Bull Ⅰnt Dairy Fed, 2002, 377: 4-19.

[3] Efsa Biohaz Panel (EFSA Panel on Biological Hazards). Scientifc opinion on the maintenance of the list of QPS biological agents intentionally added to food and feed [J]. EFSA J, 2013,11(11):3449.

[4] Flint J F, Garner M R. Feeding beneficial bacteria: A natural solution for increasing effciency and decreasing pathogens in animal agriculture [J]. J Appl Poult Res, 2009, 18(2): 367-378.

[5] Sudha R, Chauhan P, Dixit K, et al. Molecular typing and probiotic attributes of a new strain of Bacillus coagulans–Unique ⅠS-2: a potential biotherapeutic agent[J]. Genetic Eng Biotechnol J, 2010, 7: 1-20.

[6] Vos P, Garrity G, Jones D, et al. Bergey’s manual of systematic bacteriology(2nd edn )[M]. Springer Berlin: The Firmicutes, 2009:21-127.

[7] 郝小燕, 赵卫, 曹虹,等. 益生菌对肠道致病菌肠黏附抑制作用[J].中国公共卫生, 2010, 26(12): 1516-1518.

[8] Fuller R. Probiotics in man and animals [J]. J Appl Bacteriol,1989, 66(5): 365-378.

[9] Li X J, Yue L Y, Guan X F, et al. The adhesion of putative probiotic lactobacilli to cultured epithelial cells and porcine intestinal mucus [J]. J Appl Microbiol, 2008, 104(4):1082-1091.

S816

A

10.19556/j.0258-7033.2017-01-109

2016-06-27；

2016-07-26

国家级大学生创新训练计划项目资助（2015104640 24）；河南省重点科技攻关项目资助（162102210199）

张韵（1995-），女，湖南邵阳，大学本科

*通讯作者：古绍彬，博士，教授，E-mail:shaobingu@haust.edu.cn