管国强，崔鹏景，宋庆春，王源，何素，黄达明

(1.江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.镇江格瑞生物工程有限公司，江苏 镇江 212009)

枯草芽孢杆菌ZC1高密度培养的条件优化

管国强1，崔鹏景2*，宋庆春1，王源1，何素1，黄达明1

(1.江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.镇江格瑞生物工程有限公司，江苏 镇江 212009)

在摇瓶发酵条件下，采用单因素实验和响应面分析法对枯草芽孢杆菌ZC1的发酵培养基和条件进行优化，以提高其活菌数。通过单因素实验和响应面分析，确定了枯草芽孢杆菌ZC1的最佳发酵培养基：豆粕粉24 g/L、葡萄糖6 g/L、氯化钠8 g/L；发酵条件：发酵温度37 ℃、初始pH 7.5、接种量4%、摇床转速200 r/min。在此条件下，发酵24 h，枯草芽孢杆菌ZC1的活菌数由原来的1.13×1010cfu/mL提高到3.69×1010cfu/mL。

枯草芽孢杆菌；响应面；活菌含量

枯草芽孢杆菌呈杆状，很少成链，染色均匀，鞭毛侧生，芽孢0.8 μm×1.5 μm～1.8 μm游离状态的芽孢表面着色弱，萌发时芽孢壳赤道裂[1]。由于枯草芽孢杆菌生长速度快，营养需求简单，对环境耐受能力强，且具有微生物普遍存在的遗传可操作性等优点，所以成为一种常用的工业模式菌，在调味品行业、发酵、植物病害防治、养殖业、微生态制剂及医学上都有广阔的应用前景[2-4]。在调味品行业枯草芽孢杆菌应用比较广泛，枯草芽孢杆菌产生的酶可以用于制作淀粉糖、味精、柠檬酸、氨基酸等调味品及食品添加剂。

本课题组前期在实验室保藏的芽孢杆菌中筛选出一种高产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌ZC1，用于发酵生产氨基酸等调味品及食品添加剂。为了提高枯草芽孢杆菌ZC1中性蛋白酶的产量，首先需要提高种子液中枯草芽孢杆菌ZC1的活菌含量。目前，提高枯草芽孢杆菌活菌含量，主要是通过培养基和发酵条件优化及发酵罐补料调控培养来实现。如张丽霞等[5]对枯草芽孢杆菌发酵培养基进行优化，使得发酵液中菌含量从0.6×109cfu/mL提高到1.18×1010cfu/mL。贾钧辉等[6]用7 g/L发酵罐对枯草芽孢杆菌B579进行补料发酵培养，当葡萄糖浓度下降到3 g/L时，进行流加葡萄糖至浓度3～6 g/L，控制pH为7.0，发酵24 h，菌含量高达3.9×1010cfu/mL，是分批发酵的7.5倍。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枯草芽孢杆菌ZC1 江苏大学食品与生物工程学院409实验室保藏。

豆粕粉 菜场购得；葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、甘油、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硫酸锰(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司。

YC-L型冷冻恒温振荡器 镇江格瑞生物工程有限公司；立体式全自动高压灭菌锅 致微(厦门)仪器有限公司；MP5002电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；DHP-9272型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；101-2A型电热恒温鼓风干燥箱 金坛市鑫鑫实验仪器厂；快速混匀器 江苏中大仪器厂。

1.2 培养基

1.2.1 种子培养基

大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L。

1.2.2 斜面培养基

大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂15 g/L。

1.2.3 基础发酵培养基

豆粕粉20 g，蒸馏水 1000 mL。

1.3 实验方法

1.3.1 活菌菌含量测定

枯草芽孢杆菌ZC1活菌菌含量的测定采用稀释涂布平板法[7]。

1.3.2 枯草芽孢杆菌ZC1的活化及种子液的制备

将枯草芽孢杆菌ZC1转接到斜面培养基中，37 ℃培养24 h，备用。在斜面上挑取2环活化后的枯草芽孢杆菌ZC1，接入初始pH为7.2的种子液中，装液量为50 mL/250 mL，在37 ℃，转速180 r/min的摇床上培养18 h。

1.3.3 枯草芽孢杆菌ZC1生长曲线的测定

配制15组种子培养基，装液量统一为50 mL/250 mL，分别编号1～15。向1～15号种子培养基中各加入2环枯草芽孢杆菌，摇匀。发酵条件同上，在摇床上培养30 h。此后，每隔2 h测种子培养基的OD值(600 nm)，以下简称OD600，即在培养第2 h，测1号种子培养基的OD600；在培养第4 h，测2号种子培养基的OD600；以此类推，直到测完培养30 h，第15号培养基的OD600。

1.3.4 单因素实验

1.3.4.1 不同碳源对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

向基础发酵培养基中分别添加1%的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、玉米粉、甘油，以不加碳源为空白。采用摇瓶发酵培养，在接种量4%、发酵液初始pH 7.2，装液量50 mL/250 mL，发酵温度37 ℃，摇床转速180 r/min的条件下，发酵24 h后检测发酵液中的活菌含量，确定最佳碳源。

1.3.4.2 不同无机盐对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

确定最佳碳源后，向基础发酵培养基中添加1%最佳碳源以及分别添加0.6%的氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钙、硫酸镁、硫酸锰，以不加无机盐为空白。采用摇瓶发酵，发酵条件同上，发酵24 h后检测发酵液中的活菌含量，确定最佳无机盐。

1.3.4.3 不同豆粕粉、葡萄糖及氯化钠浓度对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

由上述实验确定最佳碳源为葡萄糖，最佳无机盐为氯化钠。随后采用浓度梯度方法，发酵条件一致，摇瓶发酵培养24 h后检测发酵液中的活菌含量，确定各组分最佳浓度。豆粕粉浓度分别为12，16，20，24，28，32 g/L，葡萄糖浓度分别为2，6，10，14，18 g/L，氯化钠浓度分别为3，6，9，12，15 g/L。

1.3.5 最陡爬坡试验

以适当的梯度改变豆粕粉、葡萄糖、氯化钠在培养基中的浓度，考察菌含量的变化趋势，确定最适浓度范围。

1.3.6 正交试验设计

根据单因素试验和最陡爬坡试验的结果，设计三因素三水平的正交试验，对枯草芽孢杆菌ZC1菌含量进行进一步优化。试验设计的因素水平以及编码见表1。对得到的组合进行试验验证。

表1 正交试验因素水平表

1.3.7 枯草芽孢杆菌ZC1发酵条件的优化

1.3.7.1 温度对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

将接好种子液的培养基分别置于28，31，34，37，40 ℃的摇床中，培养24 h，检测其菌含量，其他发酵条件为培养基初始pH 7.2，接种量4%，摇床转速180 r/min。

1.3.7.2 pH对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

将培养基的初始pH分别调为6.5，7，7.5，8，8.5，同样接入4%的种子液，在37 ℃，180 r/min摇床上，培养24 h，检测其菌含量。

1.3.7.3 接种量对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

向初始pH为7.2的培养基中分别接入2%，4%，6%，8%，10%的种子液，在37 ℃，180 r/min的摇床上，培养24 h，检测其菌含量。

1.3.7.4 摇床转速对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

向初始pH为7.2的培养基中接入4%的种子液，37 ℃条件下，分别在转速50，100，150，200，250 r/min的摇床中培养24 h，检测其菌含量。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌ZC1的生长曲线

微生物的生长一般分为延滞期、对数期、稳定期以及衰亡期[8]。

图1 枯草芽孢杆菌ZC1生长曲线

由图1可知，枯草芽孢杆菌ZC1延滞期较短，在0～2 h，枯草芽孢杆菌ZC1数量较少；在2～10 h，枯草芽孢杆菌ZC1进入生长对数期，菌含量急速增加；在12～24 h，枯草芽孢杆菌ZC1生长趋于平稳，细胞活力较高，在24 h左右时菌含量达到最高。之后随着培养基的营养成分减少，有害代谢物增多，菌种慢慢进入衰亡期。由此可知，选择16～24 h时的菌液进行接种较为合适。

2.2 单因素试验

2.2.1 不同碳源对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

碳源在枯草芽孢杆菌的生长过程中起着至关重要的作用，为其生长代谢提供能量[9]。

图2 不同碳源对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

由图2可知，选用玉米粉和甘油作为碳源对枯草芽孢杆菌ZC1的菌含量提高不明显。而采用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖作为碳源，菌含量都达到了2.5×1010cfu/mL左右。这从一定角度说明枯草芽孢杆菌ZC1直接利用单糖以及二糖优于玉米粉和醇类碳源，而在单糖和二糖中，枯草芽孢杆菌ZC1利用葡萄糖能力最佳。

2.2.2 不同无机盐对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

无机盐是微生物生长必不可少的营养因子，可维持生物大分子和细胞结构的稳定性，在微生物生长过程中起着重要的作用[10]。

图3 不同无机盐对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

由图3可知，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钙、硫酸镁这几组与空白组的枯草芽孢杆菌ZC1含菌量差距不大，说明这几种盐对枯草芽孢杆菌ZC1生长影响不大，而氯化钠对枯草芽孢杆菌ZC1生长具有一定的促进作用。另外，硫酸锰这组菌含量只有空白组的30%左右，不利于枯草芽孢杆菌ZC1生长，这是由于硫酸锰有助于枯草芽孢杆菌产生芽孢，抑制了枯草芽孢杆菌生长。

2.2.3 不同豆粕粉浓度对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

豆粕粉浓度对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响见图4，当豆粕粉浓度为24 g/L时，枯草芽孢杆菌ZC1生长情况最好，菌含量达到了3.14×1010cfu/mL。

图4 不同豆粕粉浓度对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

由图4可知，豆粕粉过高或过低，枯草芽孢杆菌ZC1生长都会呈现下降趋势。分析其中原因，当豆粕粉浓度过低时，培养基中营养成分不足，不利于菌种生长；当浓度偏高时，使得发酵液变得粘稠，溶氧下降，也会抑制菌种生长。

2.2.4 不同葡萄糖浓度对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

图5 不同葡萄糖浓度对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

由图5可知，不同葡萄糖浓度对枯草芽孢杆菌ZC1生长具有较大影响，当葡萄糖浓度为6 g/L时，菌种生长较好，而浓度或高或低，都会对枯草芽孢杆菌ZC1生长产生不利影响。这可能是因为葡萄糖浓度过低，使得培养基中营养不够，不利于菌种生长；浓度过高，使得培养基渗透压过高，从而导致枯草芽孢杆菌脱水，抑制其生长。

2.2.5 不同氯化钠浓度对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

图6 不同氯化钠浓度对枯草芽孢生长ZC1的影响

由图6可知，当氯化钠为6 g/L左右时，枯草芽孢杆菌ZC1生长状况最好，氯化钠浓度或高或低，枯草芽孢杆菌ZC1生长都会呈现较小趋势的下滑。这可能是因为氯化钠浓度过高，会导致发酵液中的渗透压偏高，菌体细胞容易脱水，抑制枯草芽孢杆菌的生长。

2.3 最陡爬坡试验

为了进一步确定各组分的最适浓度范围，在单因素试验的基础上，进行最陡爬坡试验。最陡爬坡实验设计与结果见表2。

表2 最陡爬坡实验设计与结果

由表2可知，随着豆粕粉、葡萄糖和氯化钠浓度逐步提高，枯草芽孢杆菌ZC1的菌含量呈现出先升高后下降的趋势。当豆粕粉为24 g/L，葡萄糖为6 g/L，氯化钠为6 g/L时，菌含量最高，达到了3.48×1010cfu/mL。由此，可以采用此浓度作为正交试验设计的中心点。

2.4 正交试验结果及分析

结合单因素实验和最陡爬坡实验，确定了豆粕粉、葡萄糖及氯化钠这3个因素。根据正交设计原理，选择这3个因素作为自变量，以枯草芽孢杆菌ZC1菌含量为指标，进行三因素三水平正交试验设计。其他发酵条件：发酵温度37 ℃，装液量为50 mL/250 mL，初始pH 7.2，摇床转速180 r/min，接种量4%。正交试验设计及结果见表3。

表3 正交试验设计及结果

由表3可知，豆粕粉、葡萄糖和氯化钠对枯草芽孢杆菌ZC1菌含量影响的主次因素为A>B>C，其中当豆粕粉含量为20～28 g/L时，对枯草芽孢杆菌菌含量影响较为显著；豆粕粉含量在24 g/L时，枯草芽孢杆菌菌含量最高；氯化钠在4～8 g/L之间时，对菌含量影响不大。根据极差值，得到最佳发酵培养基组合为A2B2C3。培养基组成：豆粕粉24 g/L、葡萄糖6 g/L、氯化钠8 g/L。在此条件下，进行3次重复试验验证，分别测得枯草芽孢杆菌菌含量为3.48×1010，3.52×1010，3.60×1010cfu/mL，平均菌含量为3.53×1010cfu/mL，证明正交试验优化得到的豆粕培养基具有一定指导意义。

2.5 枯草芽孢杆菌ZC1发酵条件的优化

2.5.1 发酵温度对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

图7 发酵温度对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

由图7可知，发酵温度在枯草芽孢杆菌生长繁殖过程中起到至关重要的作用。枯草芽孢杆菌ZC1在发酵温度为28～40 ℃，培养24 h，活菌含量较稳定，随着温度变化，菌含量先增高后降低，其中发酵温度为37 ℃时，菌含量最高，达到了3.49×1010cfu/mL。

2.5.2 不同初始pH对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

图8 初始pH对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

由图8可知，枯草芽孢杆菌ZC1的初始pH值为7.0～8.0时，生长较为稳定；当初始pH为7.5左右时，最适枯草芽孢杆菌ZC1生长增殖，菌含量达到3.59×1010cfu/mL。pH值过高或过低都不利于枯草芽孢杆菌ZC1的生长。

2.5.3 接种量对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

图9 接种量对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

由图9可知，当接种量为4%时，枯草芽孢杆菌ZC1菌含量最高，并非接种量越高，菌含量越高，这可能是由于接种量过高，发酵前期发酵液中营养物质大量消耗，引起菌种的提前衰亡，不利于枯草芽孢杆菌ZC1的高密度培养。

2.5.4 摇床转速对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

图10 摇床转速对枯草芽孢杆菌ZC1生长的影响

由图10可知，随着摇床转速增高，枯草芽孢杆菌ZC1菌含量先增高后降低，当摇床转速为200 r/min时，枯草芽孢杆菌菌含量最优，达到3.62×1010cfu/mL。分析其原因，当摇床转速过低，导致通气量偏低时，摇瓶底部的菌种供氧不足，抑制其生长；当摇床转速过快时，导致发酵液内部剪切力偏大，引起菌种机械损伤，不利于生长。

2.6 验证试验

采用上述优化得到的高密度培养条件，培养枯草芽孢杆菌ZC1，发酵24 h，检测发酵液中枯草芽孢杆菌ZC1的活菌含量，3个平行组的菌含量分别为3.72×1010，3.58×1010，3.76×1010cfu/mL，平均值为3.69×1010cfu/mL。可以看出发酵液中枯草芽孢杆菌ZC1的活菌含量明显提高，是优化前的3.5倍。

3 结论

本文考察了不同营养因子和发酵条件对枯草芽孢杆菌ZC1高密度培养的影响。通过单因素试验和响应面分析确定了枯草芽孢杆菌ZC1高密度培养的条件为豆粕粉24 g/L，葡萄糖6 g/L，氯化钠8 g/L，发酵温度37 ℃，初始pH 7.5，接种量4%，摇床转速200 r/min。在此条件下培养24 h，枯草芽孢杆菌ZC1活菌含量高达3.69×1010cfu/mL，大大提高了其活菌数，对后续中性蛋白酶酶解蛋白质生产氨基酸等调味品及食品添加剂有比较重要的意义。

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Optimization of High-density Cultivation Conditions ofBacillussubtilisZC1

GUAN Guo-qiang1, CUI Peng-jing2*, SONG Qing-chun1, WANG Yuan1, HE Su1, HUANG Da-ming1

(1.School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China; 2.Zhenjiang Green Bio-Engineering Co., Ltd., Zhenjiang 212009, China)

By shake flask fermentation, in order to increase the viable count ofBacillussubtilisZC1, the fermentation medium and conditions ofBacillussubtilisZC1 are optimized by single factor experiment and response surface methodology. According to the single factor experiment and response surface methodology, the optimal fermentation medium and conditions are as follows: soybean meal is 24 g/L, glucose is 6 g/L, sodium chloride is 8 g/L, fermentation temperature is 37 ℃, initial pH is 7.5, inoculation amount is 4%, shaking speed is 200 r/min. Being fermented for 24 h, the viable count ofBacillussubtilisZC1 is increased from 1.13×1010cfu/mL to 3.69×1010cfu/mL under such conditions.

Bacillussubtilis;response surface; viable count

2016-07-15 *通讯作者

管国强(1975-)，男，安徽巢湖人，助理研究员，研究方向：生物工程。

TS264.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.01.004

1000-9973(2017)01-0013-05