唐向辉 唐诗聪 张凡 杨日荣 张琼

乳腺癌发病率呈逐年升高趋势，主要治疗方法为手术辅予药物治疗，现有治疗手段对早期乳腺癌疗效较好，但对中晚期乳腺癌疗效并不理想，因此，探寻新的治疗靶点及手段尤为必要［1-4］。RAB22A是在哺乳动物组织中广泛存在的GTP酶，在细胞膜穿越中扮演重要角色［5-7］。研究发现，RAB22A过表达可导致细胞核形状改变，阻碍细胞核与高尔基体的分子交流［8-11］。研究表明，RAB22A在多种肿瘤中表达上调［12-14］。然而，目前关于RAB22A在乳腺癌中的表达及意义并未明确。本研究拟通过检测RAB22A在乳腺癌组织中的表达，并分析其与临床病理特征的关系，探索其在乳腺癌发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 组织标本

收集广西医科大学附属肿瘤医院2011年至2013年手术切除获取的乳腺癌组织标本及其相应癌旁组织标本（癌旁组织标本距离原发灶1 cm）60例。所有患者术后均经病理学诊断为乳腺癌，均为女性，中位年龄53岁，临床分期：Ⅰa期20例、Ⅱa期6例、Ⅱb期5例、Ⅲa期9例、Ⅲb期7例、Ⅲc期13例。术前均未接受化疗。本研究通过医院伦理审查委员会审查通过，所有患者签署知情同意书。随访时间为术后至2016年12月31日。

1.2 主要试剂

TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR®Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）、RAB22A 目的基因引物以及β-actin内参均购自广西科迪试剂公司。

1.3 实验方法

1.3.1 总RNA提取 将乳腺癌组织及其相应癌旁组织分别置于裂解液研碎，室温静置后4 000 r/min离心4 min，等体积加入70%乙醇至离心管，加入Buffer RWA、RWB并4 000 r/min离心4 min，静置后行DNase I消化并洗脱。

1.3.2 逆转录cDNA合成 将去除基因组DNA缓冲液、总RNA及RNase Free dH2O混合为10 μL体系后室温静置5 min。在上一步反应液中加入RT Primer Mix及RNase Free dH2O混合为20 μL体系。在PCR仪中37℃15 min及85℃5 s处理完成逆转录。

1.3.3 实时荧光定量PCR分析 在2 μL cDNA中加入 SYBR®Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）10 μL、RAB22A上下游引物各0.8 μL、荧光显色剂0.4 μL和dH2O（灭菌蒸馏水）6 μL混合为20 μL反应体系。在PCR仪中进行PCR反应。RAB22A特异性引物序列：上游引物为 5′-TTGTAGCCATTGCAGGA-3′，下游引物为 5′-AGGCTGTCTTCGGAGTTTGA-3′。内参 β-actin特异性序列：上游引物为5′-ATGTGCGACGACGATGTTG-3′，下游引为物为 5′-CTCGTTGTAGAAGGTGTGG-3′。反应条件：94℃预变性5 min，94℃预变 30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环，最后72℃充分延伸10 min。仪器根据标准曲线自动计算RAB22A和β-actin拷贝数，以RAB22A和β-actin比值作为RAB22A表达量。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0统计学软件分析数据，乳腺癌组织及其癌旁组织中RAB22A mRNA表达量比较采用独立样本t检验，患者基线特征比较采用χ2检验，Kaplan-Meier以及log-rank检验进行生存分析，Cox回归模型分析风险比（HR）及其95%可信区间（CI）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RAB22A mRNA在乳腺癌及其癌旁组织中的表达

RAB22A mRNA在乳腺癌组织中的相对表达量为 4.9±1.1（3.1～7.5），在癌旁组织中的相对表达量为1.1±0.3（0.4～2.1），两者比较差异有统计学意义（P＜0.01），见图1。

图1 乳腺癌及其癌旁组织中RAB22A mRNA的表达

2.2 RAB22A mRNA表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系

不同年龄、肿瘤大小以及不同ER、PR、HER-2表达状况乳腺癌患者中RAB22A mRNA的表达差异无统计学意义（P＞0.05），但不同淋巴结转移数患者RAB22A mRNA表达差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1RAB22A mRNA表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系［n（%）］

2.3 RAB22A mRNA表达与乳腺癌患者预后的关系

高表达患者总生存期较低表达患者差（HR＝0.187，95%CI：0.083～0.421，P＜0.001），见图 2。COX 比例风险回归模型分析结果显示RAB22A和淋巴结转移数是影响预后的独立因素（HR＝2.976，95%CI：1.456～3.964，P＝0.022；HR＝2.410，95%CI：1.963～3.901，P＝0.046），见表 2。

图2 乳腺癌组织中RAB22A mRNA高表达与低表达患者的生存曲线

表2 多因素Cox比例风险回归模型分析结果

3 讨论

乳腺癌是多因素、多步骤、渐进性发展的疾病，涉及多种肿瘤相关基因的表达失常或失活。在精准医疗趋势下，寻找更有效的治疗靶点成为当务之急［15-16］。近期研究认为RAB22A是肿瘤基因且与肿瘤生物学行为相关［17］。RAB22A在多种肿瘤细胞中均表达，且其表达在肿瘤侵袭、迁移、增殖、凋亡中具有一定意义［18-20］。在恶性肿瘤中，RAB22A表达较癌旁组织升高，且高表达RAB22A的肿瘤预后较差。本研究检测RAB22A在乳腺癌组织中的表达，发现其在乳腺癌组织中表达升高，而在癌旁组织中呈低表达，与上述研究结果一致，提示RAB22A或有助于乳腺癌诊断。

Miller等［18］在一项关于结直肠癌的研究中发现下调RAB22A表达可抑制肿瘤细胞增殖侵袭及迁移。有研究［16］发现，过表达RAB22A可促进黑色素瘤增殖，反之则抑制增殖和侵袭，且过表达RAB22A患者预后较低表达者差。Nakada等［7］在骨肉瘤的研究中亦观察到上述现象，下调骨肉瘤细胞中RAB22A的表达可抑制肿瘤细胞增殖与转移。本研究进一步分析RAB22A表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系，发现淋巴结转移数较多的患者其表达量升高，转移数少或没有转移的患者呈低表达，且高表达RAB22A的患者预后不佳，而COX比例风险回归模型分析显示RAB22A和淋巴结转移数是影响预后的独立因素。说明RAB22A可能发挥癌基因作用从而促进乳腺癌发生转移，导致预后不佳。但目前RAB22A在肿瘤发生、发展中发挥的作用知之甚少，其具体机制尚待进一步深入研究。

内分泌治疗在乳腺癌系统治疗中占有举足轻重的作用。随着他莫昔芬、托瑞米芬、阿那曲唑、来曲唑以及依西美坦等内分泌药物上市，激素受体阳性乳腺癌患者在术后全身治疗方面有了更多的选择，这类患者因此也能获得更多的生存获益［3］。但本研究未发现RAB22A表达与ER、PR及HER-2表达的相关性，推测RAB22A可能对乳腺癌的内分泌治疗影响不大。分析原因认为，RAB22A是GTP酶，与能量代谢方面有较大的联系，而与体内激素的调控关系不大，可能是造成RAB22A表达与ER、PR及HER-2表达无关的一个重要原因。当然，本次研究所选取的样本量较小，亦可能是影响结果的潜在因素。综上，RAB22A在乳腺癌组织中高表达，可能对乳腺癌诊断及预后评估有重要作用，有望成为乳腺癌治疗的靶点。

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