丰安徽 王伍梅 李桂娇 郭龙彪 张效忠* 崔永涛*

（1中国水稻研究所，杭州310006；2安徽农业科学院水稻研究所，合肥230000；3四川农业大学水稻研究所，成都611130；4广西瑞特种子有限责任公司，南宁 530007；*通讯作者：cuiyongtao20@163.com）

植物碱基错配修复系统中Muts蛋白家族研究进展

丰安徽1，3王伍梅2李桂娇4郭龙彪1张效忠2*崔永涛1*

（1中国水稻研究所，杭州310006；2安徽农业科学院水稻研究所，合肥230000；3四川农业大学水稻研究所，成都611130；4广西瑞特种子有限责任公司，南宁 530007；*通讯作者：cuiyongtao20@163.com）

DNA错配修复（mismatch repair，MMR）是DNA损伤修复的一个重要途径，主要用于细胞中DNA合成和遗传重组时发生损伤过程中出现的单个或少数碱基的缺失、插入以及错配的修复，它对维持基因组稳定性和DNA复制保真度至关重要。原核生物和真核生物中都有非常保守的MMR系统。在人体DNA修复系统的研究中，发现癌症的发生与Muts蛋白家族功能缺陷密切相关。类似的在拟南芥和水稻中功能缺陷的Muts蛋白家族（同源蛋白Muts homolog，MSH）会产生增变基因表型，这将为植物的基因功能分析和育种利用奠定基础。基于此，本文综述了近年来有关植物DNA错配修复及相关基因功能的研究进展，特别是植物MMR功能缺陷导致基因突变和微卫星不稳定造成的性状畸形进行了描述，对Muts蛋白家族各个亚基功能做了分类说明，并对植物中如何利用MSH产生的增变基因突变和如何利用突变育种研究进行了展望。

水稻；DNA错配修复；Muts蛋白家族；同源重组；突变；稳定

生物基因组的稳定性受到外在和内在因素影响。外在因素包括病毒、X射线、紫外线和亚硝酸盐等；而内在因素一般是由于生物体自身的复制不准确造成其基因组的不稳定，从而发生基因突变，如DNA复制和转录过程中产生的错配。为保证遗传稳定性，生物体必然要有一套修复功能来保证DNA复制过程的准确性，从而维持自身基因组的稳定[1]。变异是遗传多样性的基础，虽然基因突变有时对生物进化有促进作用，但大多情况下对生物是有害的。所以在生命的进化史上，很多生物都进化出了维持自身基因组稳定的系统。这些系统包括：（1）直接修复（direct repair，DR）通路[1]；（2）碱基切除修复（base excision repair，BER）通路[2-4]，针对氧化还原或烷基化引起的碱基损伤；（3）核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）通路[4]，修复辐射、化学药物或蛋白-DNA交联引起的核苷酸水平的损伤，（4）碱基错配修复（mismatch repair，MMR）通路[5-6]，纠正错配碱基；（5）同源重组修复（homologous recombination repair，HR）[7]；（6） 非同源的末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）[8]。此外，最近也发现了内源 RNA 转录体能介导与酵母染色体DNA的重组。不同的修复系统的保真性和修复方式有所不同，例如同源重组修复的单链断裂和非同源末端连接的双链断裂。碱基错配修复MMR是针对单碱基错配或者短核苷酸插入或缺失的，最先在原核生物中发现，随后真核生物也相继发现了MMR相关的同源基因。MMR系统的修复过程，主要包括以下几个步骤：第一步是识别新生链中非m6AGATC，第二步是扫描新生链中错配的碱基，紧接着就是酶切含错配碱基的新生DNA区段，产生的空隙由DNA聚合酶和DNA连接酶共同作用，最终修复DNA[9]。

在已知的真核生物修复系统中，MMR蛋白都具有很高的保守性[10-13]。MMR修复系统是由一系列特异性修复DNA错配碱基的酶分子组成，由于此系统的存在，细胞在DNA复制过程中才能保持忠实性，而遗传信息的完整性主要依靠DNA复制的忠实性和几种DNA修复进程的有效性，因此，MMR修复系统在维持遗传物质的完整性和保守性方面起到重要作用。MMR基因的失活会导致自身突变率增加，从而造成基因的突变和微卫星的不稳定[14]。MMR不仅在DNA修复和维持基因组稳定中起到重要作用，同时也在抑制两条非同源性DNA双链重组方面起到重要作用[15]。在原核生物中，已发现很多参与MMR修复系统的蛋白，例如大肠杆菌中，有几个MUT基因MutS、MutL、MutH和UvrD（MutU），其中MutS和MutL在多个物种中都很保守，而MutH是革兰氏阳性菌特有的。真核生物拥有保守的MutS亚基，能识别DNA复制的细微错误，从而保证基因组的稳定性[16-18]。在植物中已经鉴定到了MSH1、MSH2、MSH3、MSH4、MSH5、MSH6、MSH7、PMS1、PMS2、MLH1 和 MLH3 等基因[3，19-25]，对应的表达产物分别属于不同的亚基，并参与不同修复过程。7个MSH亚基属于MutS蛋白家族，PMS1、PMS2、MLH1和MLH3则隶属于MutY蛋白家族。这些蛋白有些直接参与DNA错配修复，有些是间接参与的，如MSH4和MSH5。虽然MSH4和MSH5未能直接参与MMR修复系统，但是根据同源性比对，MSH4、MSH5与MutY家族有很高的同源性。在这些蛋白中，MSH2和MLH1起核心作用，它们都是和其他蛋白共同形成功能性的蛋白复合体发挥作用的。在原核生物和部分真核生物中，发现MMR缺失突变体会使基因重组率增高。在植物中，虽然存在和真核生物不同的蛋白MSH7[26]，但是其他蛋白都非常保守，说明该修复系统在生物中非常保守。

尽管MMR修复系统在原核生物和动物中研究的非常清晰，但是在植物中，有关MMR修复系统的研究仍不是很清晰，尤其是在一些模式植物中，此类相关研究更是缺乏，如水稻、小麦等。在植物中，通过对模式植物拟南芥的研究，有关植物DNA修复研究已经有了很大的进展，相比动物以及一些深入研究的原核生物来说，植物也拥有很保守的修复系统，并且还拥有独特于动物的修复蛋白（MSH7），这和植物不能够移动，需要延伸出更好的修复系统非常吻合。

水稻是我国重要的粮食作物，同时也是基因功能研究的模式植物。目前，在水稻的研究中，已经发现了很多的基因以及代谢通路，但是对于MMR的研究进展还是很少。我们可以借鉴原核生物和真核生物中的MMR的研究进展作为参考，对水稻的MMR修复系统进行深入研究，特别是针对植物的特点，利用基因组不稳定性创造出有利突变，进行育种利用。

1 植物质体中MSH1的功能

MSH1是一个核编码基因，在植物中是作用于线粒体或其他质体的DNA修复蛋白[27-28]。MSH1基因无论在单子叶还是在双子叶植物中都非常保守，其对应蛋白拥有不少于6个保守区域，其中有3个区域都涉及到与DNA结合和调控重组[29-31]。植物中的MSH1最初在拟南芥中克隆出来[28]，它和细菌的DNA修复蛋白MutS同源，在维持植物细胞器基因组稳定性中起到重要作用。MSH1的表达受外界环境的影响[32-33]。植物中MSH1在进化过程中有两次大的变化[29]：第一次是蛋白C端添加了一个GIY-YIG核酸内切酶功能结构域，第二次是添加了一段DNA结合域和一段腺苷三磷酸活性结构域。目前看来，这些区域都是植物中特有的结构域。MSH1基因突变后主要导致细胞器发育相关基因和植物抗逆基因的表达量变化。MSH1基因失去功能后，线粒体基因组的重复序列处交换率明显增加，并且还会影响核基因的表达。在拟南芥中，当MSH1基因被破坏后，其线粒体中的同源重组率显著提升，这是由于拟南芥线粒体基因组有超过47条重复序列，且都响应了MSH1基因突变[33]。此外，当MSH1基因被破坏后，叶绿体基因组DNA重排率也出现了下降。当MSH1基因被干涉掉后，高粱、小米、烟草、西红柿和大豆的后代会出现类似的表型[31]，包括雄性不育、植株变矮、分支增多等基本类似的性状。例如，在烟草和西红柿中，MSH1基因被破坏掉后，其细胞质雄性不育显著提升[34]。这一系列的证据进一步说明了该基因在植物中具有很高的保守性；对RNAi干涉的土豆、烟草、小米和高粱中发现其质体发育不完全会导致叶片出现绿白镶嵌的表型，表明了MSH1在这些杂色叶子的发育中起到重要作用[27]。对全基因组进行甲基化分析发现msh1突变体的甲基化发生了变化，甲基化区域包括非CG岛和着丝粒区域[35]。用msh1突变体和野生型进行杂交，其后代生活活性显著升高，说明MSH1基因在植物表观遗传调控中也起到很重要的作用[31]。目前推测MSH1可能是介导siRNA调控植物基因组甲基化，当然仍需要进一步研究证实。

MSH1基因突变体在育种中也有很大的利用前景。在高粱中，MSH1突变可以产生不同表型的突变体，进而从其后代中选择一些有利的表型，如穗型、开花时间、较高的生物量等。除此之外，它还可以产生超过4年的稳定变异的突变体，结合传统育种方法，可以从中寻找到较好的育种材料。细胞质雄性不育主要是由于线粒体开放阅读框发生了改变，而线粒体基因组在植物基因组进化中起到很大的作用。MSH1突变主要是让线粒体基因组发生重排，因此可以利用MSH1突变体创造一些细胞质雄性不育材料。研究者发现，将1个芥菜材料MSH1基因干涉掉以后，可以提高芥菜线粒体ORF220拷贝数，并且其干涉突变体花药发育基因出现上调和下降，该成果可以为以后细胞质雄性不育的研究提供参考[36]。此外，人们对1个西红柿MSH1基因无义突变体进行研究，发现其后代的生长活力出现明显增加，研究者推测这可能是由于突变体表观遗传导致的。当用DNA甲基化抑制剂处理后，突变体的生长活力下降至野生型水平。这些数据都为以后表观育种提供了思路，同时也再次证明了表观遗传在影响植物生长中起到的重要作用[37]。同时又对西红柿和土豆进行MSH1干涉处理后，发现都出现了同样的表型，包括可遗传的雄性不育以及线粒体重排明显增加，加之以上芥菜等的研究，我们可以大胆推测此类雄性不育材料有可能在未来育种中得以应用。

2 MSH2和MSH3，MSH6/MSH7形成二聚体介导植物基因组稳定

在细菌以及其他真核生物中，MSH2、MSH6以及MSH3已经被证实能够形成异源二聚体。在拟南芥中，有2个类MSH6蛋白AtMSH6和AtMSH7。AtMSH2分别和 AtMSH3、AtMSH6还有 AtMSH7形成二聚体，AtMSH2/AtMSH3（MutSβ）二聚体主要是识别单碱基的插入或缺失2-8bp的茎环结构。AtMSH2/AtMSH6（MutSα）二聚体主要识别单碱基替换和短的IDLs，AtMSH2/AtMSH7（MutSγ）主要识别 T/G 替换[38-39]。体外实验证明了MSH2和MSH6之间的相互作用与MSH2和MSH7之间的相互作用非常类似，且比MSH2和MSH3更易形成二聚体[38]。MSH6和MSH7与其他修复蛋白相互作用的结构域类似，并且都很保守[9]，但是在MSH3中却未发现含有此类保守的结构域。这说明了MSH2和MSH3形成的二聚体可能是通过其他方式结合损伤的 DNA[38，40-41]。

拟南芥和玉米的MSH7和MSH6有很高的同源性[42-43]。MSH6有近30%的氨基酸保守，长度也只比其他MSH6短了57～250个氨基酸；MSH7和其他MSH蛋白类似，存在一些共同的保守的结构域。拟南芥MSH6和MSH7蛋白的氨基端都存在保守的错配结合区域，该区域和PCNA（在DNA修复前和修复后都起到重要作用）以及DNA复制蛋白A相互作用[44-47]，在DNA修复中起到重要作用。拟南芥AtMSH2主要在愈伤组织或幼苗中表达，在花序分生组织中的表达量也相对较高。在玉米中也发现了MSH2和MSH7的同源蛋白Mus1和Mus2，但表达量都非常低[3]。

同源重组过程，首先是由一个单链的入侵形成异源双链，当两条异源双链存在单碱基不同时，就会产生错配，有可能会使同源重组提前终止，并且两条序列变异度越高，同源重组率越低；相反同源重组的两条链的相似度越高，同源重组率就越高，产生等位基因的可能性也就越高。在酵母细胞里，序列变异度为1%时，可以使同源重组率降低5～23倍，而当序列变异度增长到15%时，其重组率下降了700倍[48]。在植物里，序列变异度为1.6%和1.9%时，可以使重组率降低3.6倍和9.6倍[49-50]。同源重组主要是在染色体的一些重复序列中产生，部分研究证明，当这些反向序列变异度从0.5%增长到9%时，其重组率也相应的下降了4～20倍[51]，这些结果都说明了序列相似度影响重组率。MMR修复系统在同源重组中起到很重要的作用。在细菌和酵母以及哺乳动物中，当MMR蛋白功能缺失后，基因组的重组率会明显增加[52-55]。而在植物中，当MSH2蛋白功能缺失后，其重组率也会增加。例如，在拟南芥MSH2基因缺失突变体中，当野生型和突变体植株序列变异度同时增加后，野生型植株的重组率明显下降，而突变型几乎没有变化[15，56]。

MMR修复系统中，MSH2在识别错配碱基过程中起到很重要的作用，而AtMSH2则会抑制同源重组。在MSH-like家族中，AtMSH2是研究最为深入的一种蛋白，当该蛋白功能缺失后，会导致微卫星序列不稳定，同时作为一个增变基因产生一系列突变的后代。说明AtMSH2在维持基因组稳定性中起到重要作用。拟南芥msh2突变体无论是在减数分裂还是有丝分裂，当AtMSH2功能缺失后，其同源重组率显著上升[14，57]。

植物几乎都在阳光下生长，经常受到紫外光的照射产生氧代谢产物，影响植物基因组的稳定、种子的发育等，因此植物必须有一套系统来对抗紫外线引起的损伤。早在之前就有这样的发现，MSH2在动物受到紫外照射后，会在表皮细胞积累[58]，这与在MSH2和MSH6缺失突变体中，动物患皮肤癌的概率明显增加相一致[59]。也有相关证据证明，MSH蛋白在细胞周期调控中起作用，而细胞周期调控正好和细胞衰老以及细胞代谢相关[60-61]。这些都说明了MSH蛋白在修复细胞受到紫外损伤中起到了重要作用。近年，在植物中的研究也逐渐证明了MSH蛋白在修复紫外损伤中起作用。当玉米受到紫外照射后，发现其MSH蛋白表达量增加[62]。紫外处理拟南芥后发现，MSH2和MSH6蛋白的表达量也增加了，这证明MSH2和MSH6蛋白形成的二聚体可能会修复因紫外而损伤的DNA，从而使植物基因组保持稳定。对拟南芥MSH2和MSH6突变体进行紫外处理，发现植株内部氧化代谢产物明显增加[5]。这些证据都说明了MMR修复系统对植物由紫外造成的DNA损伤修复起到重要作用，并且存在普遍性。

MMR修复系统产生紊乱后会出现一些很明显的特征，例如，当生物基因组不稳定时，其基因组微卫星的突变频率会有变化，这在人类等生物中已经得到证实。在植物中也开始有所研究，并且发现也会出现微卫星不稳定等特征。在已经鉴定到的MSH2突变体中，微卫星都表现出明显的不稳定性。例如，酵母Msh2突变体的细胞内的微卫星的不稳定性出现了增加，并且抗逆性也有所增加，MSH3突变体也表现出类似的表型。除此之外，在MSH6突变体中，其点突变和微卫星不稳定性都明显增高。这些说明了此类MMR蛋白在维持体内微卫星稳定性上起到重要作用，并且在原核生物和动物中都存在，说明MMR蛋白在生物中是普遍存在的。而在植物中，尽管研究不多，但是已经发现这类MMR在维持体内微卫星稳定性中也起到重要作用，并且出现类似于原核生物和动物的现象。例如，拟南芥MSH2突变体中微卫星的不稳定性有所增加。此外还发现了MSH7和MSH6也会影响植物的产量，在1个大麦的MSH7缺失突变体中，其结实率和千粒重都低于野生型[26]，而在水稻的MSH6的3个T-DNA插入突变体中发现部分株系的结实率和产量也有所下降[63]。这可能是此类蛋白影响植物体内基因同源重组而导致了生长紊乱。

MMR家族在抑制基因同源重组中起到重要作用，微卫星不稳定就是由于基因的同源重组率出现了增加。而同源重组是产生等位基因的方式之一。因此，更好的理解植物是如何保护其基因组稳定，特别是怎么样抑制同源重组，对育种也有很大的帮助。育种专家特别希望植物后代的变异度增加，以便从中筛选到良好的育种材料，从而提高产量。因此，对于同源重组必须要进行深入的研究，以为植物育种提供基础。

3 MSH4和MSH5作用于减数分裂

在原核生物中，MSH4和MSH5主要是在减数分裂中起作用。细胞在减数分裂中会发生同源重组，双链DNA在进行同源重组首先是由双链断裂的3'端侵入，进入其同源序列，形成Holliday结构，而MSH4和MSH5就是形成Holliday交叉结构所必须的[64-66]。在人类中，hMSH4和hMSH5形成二聚体在Holliday结构中交叉点的节点处起作用[67]。早在2004年就有学者在拟南芥中鉴定到了MSH4基因[68]，该基因突变后不会影响营养生长，但是其花粉败育率明显增加，与野生型进一步对比发现，在四分体时，其同源重组交叉点明显变少，即便是存在交叉点，在细胞中也是非常散乱的，毫无规律性可言。拟南芥中MSH5主要是在重组的后期起作用[23]，当MSH5失去功能后，染色体联会能够实现，但是染色体联会后，第一次减数分裂却出现延迟，相比野生型，延迟达到8 h左右。拟南芥的MSH5虽然比人类的MSH5要短，但是其C端与人类、酵母等其他真核生物一样都非常保守[23]。MSH5包含1个保守的螺旋-转角-螺旋结构[69]，缺乏识别错配DNA的结构。拟南芥MSH5基因主要在花蕾和花序等有性生殖器官表达[23]，这和MSH5主要在减数分裂起作用十分吻合。MSH5和MSH4必须形成二聚体才具有功能，二者缺一不可。免疫共沉淀实验证明，无论缺少哪个蛋白，二聚体都无法形成。水稻MSH5和MSH4也是形成二聚体才能发挥作用。在水稻的1个MSH4缺失突变体中，研究者发现虽然其联会复合物能够形成，但是其联会后的交叉点显著下降，将可以形成二聚体的MSH4和MSH5同时突变后，交叉点仍会下降。与拟南芥以及其他生物相同，酵母双杂和蛋白拽拉实验也证明了基因MSH4和MSH5是相互作用的，这也说明了其对应的2个蛋白具有很强的保守性[23]。同拟南芥相似的是，水稻中该二聚体也是在Holliday结构中交叉点起作用，主要是促进CO的形成。水稻的MSH5突变体在营养生长期展示出正常的表型，而在生殖生长期，出现严重的败育。实验发现，相对于野生型，突变体细胞在减数分裂过程中联会复合物能够正常形成，但是重组过程中产生的交叉点却不能分离，导致水稻败育。MSH5基因主要是在穗部表达，这和拟南芥表达谱类似。在染色体区域，该基因主要是在第一次减数分裂前期发挥作用[70]。

4 展望

MMR在不同生物体中是一个保守的DNA修复途径。人们已经详细地研究了这种用于DNA修复途径的机制，并且已经从拟南芥中鉴定和克隆了重要的组分如MutS和MutL[20，71-72]。拟南芥MSH基因的相关研究证实了MSH基因家族在进化中非常保守，并且大部分MSH基因都只有1个单拷贝，目前仍需要相关的研究去进一步探索MMR在DNA修复系统中所起的作用。

对于模式植物水稻来说，更加有必要加大其相关研究，探究MMR对水稻一些重要的农艺性状的影响。水稻诱变育种通常是利用水稻有利的农艺性状突变基因，通过不同性状互补的品种之间杂交产生优良农艺性状的后代，这个过程涉及到生物体内在的基因组信息交流和维持的过程。而它们都需要MMR系统的参与。已知水稻体内单碱基突变容易被MMR系统修复，而杂交会涉及到MMR系统对同源重组的抑制。目前其他作物或植物中有些已得到证实，例如，在拟南芥中MMR系统紊乱后，其后代突变效率明显增加[73-74]。

目前已有的研究显示，在水稻中，抑制MMR基因会增加同源重组率，这使其后代变异类型更加丰富；而且抑制MMR相比传统的EMS诱变除了可以诱导单核苷酸突变还会造成微卫星的不稳定性。尽管MMR在不同物种中是一个保守的DNA修复途径，但在不同生物体内也会存在差异，曾经有人通过负反馈调节籼稻Shuangsixiangzhan和粳稻Zhonghua11的MMR，发现在矮秆和致死等农艺性状方面前者要比后者发生的概率要大得多[75]。

通常情况下，MMR发生基因突变可以增加基因组的不稳定性，严重时会导致植物的表型出现不同程度的异常，甚至让植物体无法存活，这也为以后在水稻育种中对其加以利用提出了难题。然而在水稻中寻找到对其表型影响不大，但后代突变频率增加的MMR突变体却是可行的，利用这些突变体与骨干亲本杂交，可以在短期内创造出更多优异的亲本材料。

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Abstract:DNA mismatch repair（mismatch repair,MMR）is an important way of DNA damage repair,and it is mainly used to repair the lack of a single or a few bases,insert and mismatch in the process of DNA damage occurred when DNA synthesis and genetic recombination in the cell,which is very important to maintain genomic stability and DNA replication fidelity.MMR systems are very conservative in both prokaryotes and eukaryotes.It was found that the occurrence of cancer is closely associated with functional defect of the Muts-protein family in the study of human DNA repair system.Similarly,it has been found that functional defect of the Mutsprotein family will appear gene mutant or phenotypes in the Arabidopsis and rice,which will lay the foundation for the further study of plant functional gene analysis and breeding.In this paper,the author reviewed recent advances in the research of mismatch repair of plant DNA and the function of related genes,especially the mutations caused by plant MMR functional defects and microsatellite instability.It is suggested that MMR mutants can be used as a reference for further breeding of MMR-deficient mutants.

Key words:rice;DNA mismatch repair;Muts-protein family;homologous recombination;mutation;stability

Research Progress of Muts-Protein Family in Plant DNA Mismatch Repair System

FENG Anhui1,3,WANG Wumei2,LI Guijiao4,GUO Longbiao1,ZHANG Xiaozhong2*,CUI Yongtao1*
（1China National Rice Research Institute,Hangzhou 310006,China;2Rice Research Institute,Anhui Academy of Agricultural Sciences,Hefei 230031,China;3Rice Research Institute of Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China;4Guangxi Ruite Seeds Co.,Ltd,Nanning 530001,China;*Corresponding author:cuiyongtao20@163.com）

S511

A

1006-8082（2017）05-0005-07

2017－06－06

国家科技支撑计划（2015BAD01B02-2）