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核桃青皮活性物质提取方法及其抑菌作用研究进展

2017-02-03杜慧平赵瑞芬燕照玲

河南农业科学 2017年9期
关键词:青皮核桃物质

杜慧平,赵瑞芬,燕照玲

(1.山西省农业科学院 现代农业研究中心,山西 太原 030031; 2.山西省农业科学院农业环境与资源研究所/土壤环境与养分资源山西省重点实验室,山西 太原 030031;3.河南省农业科学院 农业经济与信息研究所,河南 郑州 450002)

核桃青皮活性物质提取方法及其抑菌作用研究进展

杜慧平1,赵瑞芬2*,燕照玲3

(1.山西省农业科学院 现代农业研究中心,山西 太原 030031; 2.山西省农业科学院农业环境与资源研究所/土壤环境与养分资源山西省重点实验室,山西 太原 030031;3.河南省农业科学院 农业经济与信息研究所,河南 郑州 450002)

核桃青皮作为核桃生产中的副产物,一直被视为废料而弃之,不仅造成了环境污染,同时也浪费了自然资源。随着核桃青皮的利用价值逐渐被发现,国内外学者对其进行了深入研究和探索,并取得了一定的成果。就核桃青皮中活性物质的有效成分、提取方法及其抑菌作用方面的研究进展进行了综述,并对核桃青皮研究的前景进行展望,为核桃青皮的农业开发利用提供一定参考。

核桃青皮; 胡桃醌; 活性物质; 提取; 抑菌作用

核桃(JuglansregiaL.)又名胡桃,属于被子植物门双子叶植物纲胡桃科植物,素有“木本油料之王”的称号,与腰果、榛子、扁桃并称为世界著名的“四大干果”。 核桃全身是宝,核桃仁中含有丰富的蛋白质、脂肪酸及多种对人体有益的营养物质,具有很高的药用价值和营养价值。核桃外果皮是一种厚厚的绿色果皮,在中医验方中被称为“青龙衣”,其味辛、苦、涩,性平、微寒,具有清热、解毒、抗肿瘤之功效,能够治疗痢疾、目赤、泄泻、白带等疾病[1-2];另外,核桃青皮还被应用于染发、染料、制革纺织以及肥料生产中[3-4]。

我国是世界上核桃生产大国,其主要分布在新疆、云南、山西、陕西以及河北等地区。核桃资源丰富,每年只有少量的青皮用于医药、染料等行业中,大量的核桃青皮乱堆乱放,造成了环境污染。近年来,人们对核桃青皮的成分开展了大量的研究,结果表明,核桃青皮中含有抑菌活性物质,其浸出液可以抑制枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等多种病原菌[5]。针对核桃青皮的主要化学成分提取方法及其抑菌作用研究进展进行了综述,旨在为核桃青皮中抑菌活性物质的提取、开发和利用提供一定理论支撑。

1 核桃青皮中活性物质的有效成分及含量

1.1萘醌类物质

醌类物质是核桃青皮中最主要的一种物质,也是学者们研究最多的一类物质。目前研究发现,核桃青皮中含有胡桃醌和3,3′-双胡桃醌、3,6′-双胡桃醌[6];4,5-二羟基-α-四氢萘醌、4-乙氧基-8-羟基-α-四氢萘醌、4,5-O-异丙叉基-α-四氢萘醌、5,8-二羟基-4-甲氧基-α-四氢萘醌[7]; 2,5 - 二羟基-1,4 - 萘醌、2-羟基-1,4-萘醌、3,5 -二羟基-1,4-萘醌、5-甲氧基-1,4-萘醌、5,8-二羟基-1,4-萘醌[8]。在各种萘醌类、酮类、醛类、酸类、醇类、呋喃类等物质中,胡桃醌的含量最高,占27.11%~31.20%[9]。胡桃醌的分离、提纯及鉴定报道最早见于1957年的国外文献[10],而我国学者们从1986 年开始对胡桃科树种不同部位的胡桃醌进行分离提纯研究[6]。温文兵等[11]研究表明,不同树种青皮中胡桃醌含量差异显著,核桃青皮中的胡桃醌高于山核桃。胡桃醌含量不稳定,受采摘时间、干燥方法及贮藏年限的影响[12],存储9 a不同时间段的核桃青皮中胡桃醌含量随着存储年限的延长而减少[13],因此,开发利用时应在核桃成熟期间采摘,当季阴干,立即使用[14]。

1.2黄酮和多酚类物质

核桃青皮中的主要黄酮类化合物包括黄酮醇、黄酮醇苷、芦丁、山奈酚、金丝桃苷、槲皮素等[15]。多酚类物质主要有单宁类、酚酸类、黄烷醇类以及花色苷类物质等[16]。多酚是植物体内合成的一种重要的次级代谢产物,具有独特的功能活性[17],在常见的可食性植物组织中都可以提取到。植物单宁,又称植物多酚,在青皮中为水解类,采用不同测定方法获取的单宁含量不同,其中,采用分光光度法测定的核桃青皮中单宁含量为4.06%[18],而采用Zn2+络合法测定的核桃青皮中单宁含量为19.24%[19]。

Cosmulescu等[20]研究发现,核桃青皮含有杨梅素、香草酸、丁香酸、香豆素、阿魏酸 5 种酚类物质,不同品种所含的5种物质比例不同,但总酚含量无显著性差异,5种酚类总量约为41.2 mg/kg。万政敏[21]研究发现,核桃青皮中含有没食子酸、阿魏酸、绿原酸、香豆酸、 咖啡酸、对羟基苯甲酸6种酚类,总量约为751 mg/kg,此外,含有芦丁、槲皮素、桑色素等黄酮类物质约502 mg/kg。

1.3二芳基庚烷类

李义秀等[22]研究发现,核桃青皮中含有 11a-20E-dihydroxydamar-24-ene-3-one(-)、Jugcathayenin A、Myricatomentogenin和 Regiolone共4种二芳基庚烷类化合物。周媛媛等[23]采用核桃青皮乙醇提取物,经氯仿及醋酸乙酯萃取分离得到胡桃苷A、枫杨素、3′,4′-环氧-1-(4′-羟苯基 )-7-(3″-甲氧苯基)-庚烷-3-羟基、茸毛香杨梅酮、3′,4′-环氧-1-(4′-羟苯基)-7-(3″-甲氧苯基)-庚烷-2-羟基-3-酮等 5 个二芳基庚烷类化合物,总含量约为 79.26%。王磊[24]采用活性跟踪法从核桃青皮乙醇提取物乙酸乙酯萃取相中分离出 2,6,10,14-四甲基十六烷(9.12%)和 D-阿洛糖(6.92%)。

2 核桃青皮中活性物质的提取及检测方法

2.1胡桃醌的提取方法

孙墨珑等[25]在料液比为1∶15条件下,采用60%乙醇水溶液60 ℃振荡浸提、索氏抽提、超声浸提3种方法提取核桃楸外果皮、树枝及树叶中的总黄酮和胡桃醌,结果表明,超声浸提法优于常规浸提法和索氏抽提法,采用该方法提取后,测得外果皮中总黄酮含量为3.05%,胡桃醌含量为0.002 29%。王文泽等[26]通过高效液相色谱(HPLC)法测定胡桃醌含量,在料液比为1∶15条件下,研究了浸提方法、浸提剂、温度及时间对青皮中胡桃醌浸提率的影响,结果显示,索氏抽提、冷浸提和超声浸提3种方法中,超声浸提法所用时间短、提取率高;氯仿、丙酮、甲醇、乙醇、乙醚和乙酸乙酯6种浸提剂中,丙酮浸提率最高,为0.540%,其次为乙酸乙酯,浸提率为0.490%;最佳温度为60 ℃,最佳浸提时间为30 min。李秀凤等[27]采用5% NaOH恒温回流,减压过滤后,用浓盐酸滴定沉淀获取滤渣中的胡桃醌提取物,胡桃醌提取率为52%,含量为0.062%。丁存宝等[28]在料液比为1∶5条件下,采用乙酸乙酯、石油醚、正丁醇、95%乙醇常温振荡提取核桃青皮中的活性物质,结果发现,乙酸乙酯提取的胡桃醌含量最高,正丁醇最低;乙酸乙酯提取的黄酮含量最高,石油醚最低;正丁醇提取的多糖含量最高,95%乙醇最低。综上所述,胡桃醌的提取受浸提剂极性及浸提方法的影响,浸提剂极性越强,胡桃醌浸提率越高;超声浸提法所用的时间较短,操作简便,且浸提率较高。

2.2胡桃醌的检测方法

索绪斌等[13]建立了HPLC测定核桃青皮中胡桃醌的方法,其色谱条件为Shimpack-ODS反相色谱柱、甲醇-5%磷酸二氢钠(3∶1)流动相、室温进样、紫外检测器检测,该方法加样回收率为97.21%,RSD为1.23%,测得的胡桃醌含量为0.43%。刘丹萍等[29]用氯仿超声浸提山核桃外果皮后,采用HPLC法测得山核桃青皮干样中胡桃醌的含量为0.001 04%。孙墨珑等[30]建立了用甲醇溶解样品,分光光度计在426 nm波长下测定核桃树皮中胡桃醌含量的方法,该法加样回收率为99.6%,简单易行,测定准确。孙墨珑等[31]建立了减压蒸馏、气质联用仪测定胡桃醌含量的方法,测定条件为采用DB-17MS型毛细管色谱柱、设定气化室温度为260 ℃、电离源为EI,该方法测得胡桃醌相对含量高达96.42%。核桃青皮中的胡桃醌因检测设备不同,测定的结果差异很大。

2.3其他活性物质的提取及检测方法

高小宁[9]采用80%的乙醇回流提取核桃青皮,通过反复硅胶层析、聚酰胺柱层析、Sephadex LH-2凝胶柱分离得到9种化合物:胡桃醌、胡桃素、β-谷甾醇、核桃酮、胡桃酮、3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸、香草酸、槲皮素、山萘酚;采用气相色谱-质谱(GC-MS)鉴别出氯仿相中含有15种化合物,包括5种酯类,3种酚类,2种酮类,萘醌、醇、呋喃、酸、醛各1种,其中,胡桃醌为主要物质,约占27.11%;鉴别出乙酸乙酯相中含有24种化合物,胡桃醌为主要物质,占31.20%。张建斌等[32]采用硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶色谱和薄层色谱等分离方法从核桃青皮中分离得到4,5-O-异丙叉基-α-四氢萘醌、二氢红花菜豆酸、白桦脂酸、泰国树脂酸、4-甲氧基-α-四氢萘醌-5-O-α-葡萄糖苷、胡萝卜苷、4-乙氧基-8羟基-α-四氢萘醌和2,3-二羟基-1-(4-羟基取代苯基)-1 -丙酮8个单体化合物。王宏歌等[33]建立了减压蒸馏、GC-MS测定核桃楸青皮中挥发性物质的方法,其中,GC-MS的条件为HP-5MS型毛细管色谱柱、气化室温度280 ℃、EI离子源,该方法测得的挥发性油状物质含量为2 mL/kg;测定出45种挥发性物质,占总馏分的95.22%,其中,6种酯类占总馏分的21.46%,9种醇类占总馏分的18.01%,7种烯烃类占总馏分的12.38%,4种含氧衍生物占总馏分的11.98%,3种酚类占总馏分的5.31%,3种酮类占总馏分的5.26%。张卫星等[34]采用无水甲醇在料液比1∶15条件下65 ℃回流浸提核桃青皮,得到的粗提物中总酚含量为41.56 mg/g;应用氯仿、石油醚、正丁醇相、乙酸乙酯对青皮甲醇提取物进一步萃取,760 nm下分光光度法测得乙酸乙酯相总酚含量最高,为193.52 mg/g,其后依次是氯仿、正丁醇相,石油醚相中总酚含量最低,为37.35 mg/g。丁芸等[35]以亚临界水作为提取剂建立了一种环保、简单、易操作的核桃青皮中活性物质提取方法:青皮粒度为0.178 mm,萃取温度为194 ℃,萃取时间为55 min;该方法得到的总黄酮、单宁酸和蒽醌的提取率分别为87.43、56.03、4.12 mg/g,总提取率为147.58 mg/g。

3 核桃青皮中活性物质的抑菌作用及机制

核桃青皮中的活性物质胡桃醌、黄酮类及二芳基庚烷类物质具有抑菌作用,浸提剂的极性不同、浸提方法及分离方法不同,从核桃青皮中浸提出的活性物质种类及总量不同,因而对不同的菌种也产生不同的抑制效果[36]。

当核桃青皮甲醇提取物的质量浓度为0.1 g/mL时,对黄瓜灰霉病菌菌丝生长的抑制率为85.40%,对小麦白粉病菌的抑制率为75.00%,对黄瓜霜霉病菌的抑制率为56.62%;且抑菌活性随着提取物质量浓度的增加而增强[37]。翟梅枝等[38]研究表明,当核桃青皮乙醇提取物质量浓度为40 mg/mL时,其乙酸乙酯萃取相对棉花立枯菌、小麦纹枯菌和番茄灰霉菌3种病原真菌的抑制率均达到100%;乙酸乙酯萃取相的质量浓度不同,对不同种类病原菌的抑制效果也不同,其抑制小麦纹枯菌、棉花立枯菌、番茄灰霉菌、苹果炭疽菌和小麦赤霉菌5种病原菌的50%有效质量浓度(EC50)分别为5.591 2、6.219 1、7.263 4、9.069 5、10.310 2 mg/mL。当核桃青皮提取物质量浓度为50 mg/mL时,其可以显著抑制大肠杆菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌[34]。王宏歌等[33]研究结果表明,10%的核桃楸外果皮挥发性馏液可显著抑制杨树叶枯病菌和樟子松枯梢病菌。

胡桃醌是核桃青皮中的主要毒性物质,具有较强的抑菌和抗癌作用,其毒性一般大于醌类衍生物[39]。胡桃醌及其衍生物5,8-二羟基-1,4-萘醌对供试的红景天立枯病菌等12种病原菌都有抑制作用,对玉米小斑病菌和镰刀属4种病原菌孢子萌发的抑制率为60%[40]。刘丹萍等[29]研究了胡桃醌对9种病菌菌丝生长的抑制作用,结果表明,胡桃醌对水稻纹枯病菌菌丝生长的抑制作用最强,其EC50为7.022 6 mg/L;对苹果炭疽病菌孢子萌发的抑制作用最强,其EC50为0.508 0 mg/L。核桃青皮的乙酸乙酯浸提液显著抑制酵母菌、青霉、木霉的生长,其中,胡桃醌为主要的抑菌活性物质[28]。核桃青皮乙醇粗提物及其三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯萃取物显著抑制辣椒疫霉病菌、葡萄蔓枯病菌和葡萄溃疡病菌的菌丝生长,从中分离获得的胡桃素对葡萄蔓枯病菌和辣椒疫霉病菌菌丝生长的EC50分别为0.060、0.124 mg/mL[41]。

吴朝霞等[42-44]研究表明,当胡桃醌最低质量浓度为75 μg/mL时可抑制大肠杆菌的生长,表现为大肠杆菌细胞内的电解质和大分子蛋白质出现泄漏,随胡桃醌质量浓度的增大,细胞膜受损加重;胡桃醌作用于大肠杆菌24 h,菌体的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性降低,丙二醛(MDA)含量升高。推测胡桃醌对细菌的抑制作用主要发生在生长的延缓期和对数期,其可能通过破坏菌体的细胞壁或细胞膜结构抑制其生长,最终导致细菌无法正常生长,直接进入衰亡期。许紫峻等[45]研究表明,随核桃青皮提取物浓度增加,其对霉菌的抑菌率由29.0%增加到62.4%;用核桃青皮70%乙醇提取液处理霉菌,霉菌的电导率在10 h内持续增加,并且在2 h时电解质外渗率达到高峰,MDA含量明显增加且达最大值,CAT活性显著降低,同时霉菌细胞结构模糊不清。因此,核桃青皮乙醇提取液对霉菌的作用机制是破坏其细胞膜,而霉菌细胞自身的抗逆能力不足以对抗这种作用,从而导致死亡。

4 展望

核桃青皮是核桃生产过程中产生的副产品,含有胡桃醌、黄酮、多酚类及二芳基庚烷类等活性物质,这些活性物质具有抗菌活性,在农业生产中具有重要的利用价值。因此,核桃青皮中活性物质的提取及其抑菌作用成为研究的热点。关于核桃青皮中活性物质的提取,科研工作者们在浸提试剂、浸提方式、检测方法方面做了大量的研究工作,所发现的活性物质成分数量和种类大大增多,浸提方法更环保、更快速,分离和鉴别技术也日趋精密,但是由于核桃青皮中活性物质受品种、采后储存时间、储存方式和提取方法的影响,仍需完善浸提技术和分离技术,以期得到高纯度、高提取率的活性物质。青皮中含有大量具有抑菌、抗氧化作用的活性物质,应深入研究不同活性物质的抑菌机制,进一步发挥核桃青皮在药用和植物保护中的作用[46]。另外,核桃青皮营养元素丰富,应加强青皮施入土壤对土壤和植物的影响研究,以期在肥料加工业有新进展[47]。核桃青皮色素是一种天然的着色剂,应加强其环保、绿色浸提方法及着色条件的研究,进一步探索青皮在纺织和化妆业上的应用。随着采用高新技术手段对核桃青皮成分及其作用机制的深入研究,核桃青皮将会在多个领域发挥更大的作用。

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Research Progress on Extraction Methods and Antibacterial Effect of Active Substances from Walnut Green Husks

DU Huiping1,ZHAO Ruifen2*,YAN Zhaoling3

(1.Research Center of Modern Agriculture,Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Taiyuan 030031,China;2.Institute of Agricultural Environment and Resources,Shanxi Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Soil Environment and Nutrient Resources of Shanxi Province,Taiyuan 030031,China;3.Institute of Agricultural Economics and Information,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

Walnut green husks are a kind of by-product of walnut production,and have been regarded as waste and abandoned,which not only pollutes the environment,but also is a waste of natural resources.With the discovery of its values,some deep-researches and explorations were carried out,and certain results were achieved.The paper reviewed the progress on effective ingredients,extraction methods and bacteriostasis of active substances from walnut green husks,and looked forward to the development prospects of walnut green husks,which could provide some references for further development and utilization of abundant resources of walnut green husks in agriculture.

walnut green husks; juglone; active substance; extraction; antibacterial effect

2017-06-20

山西省科技攻关项目(20150311014-4);山西省农业科学院农业科技创新研究课题(ZDFYS1511)

杜慧平(1974-),女,山西长子人,助理研究员,硕士,主要从事土壤污染修复研究及农业期刊编辑出版工作。 E-mail:sxnykxdu@126.com

*通讯作者:赵瑞芬(1977-),女,山西寿阳人,副研究员,硕士,主要从事植物营养和土壤污染修复研究。 E-mail:tfszrf@163.com

S664.1

: A

: 1004-3268(2017)09-0001-05

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