■文/山东绿都生物科技有限公司 李天芝 于新友

新型猪口蹄疫疫苗研究进展

■文/山东绿都生物科技有限公司 李天芝 于新友

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的偶蹄的一种急性、热性、高度接触性传染病，该病传染性强、传播速度快、危害严重，给畜牧业造成了严重的经济损失，接种疫苗是防控口蹄疫的重要手段。本文介绍了口蹄疫亚单位疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗、表位疫苗、活载体疫苗、基因缺失/标记疫苗和病毒样颗粒疫苗等几种猪口蹄疫新型疫苗的研究进展情况，以期为口蹄疫的防控提供参考。

猪口蹄疫；新型疫苗；研究进展

口蹄 疫（Foot and Mouth Disease，FMD）是由口蹄疫病毒引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，可感染猪、牛、羊等70多种动物[1]。FMD传染性强、传播快、流行范围广，且能以气溶胶的形式远距离传播，一旦发生，往往造成大范围流行，不易控制和消灭，给畜牧业造成巨大的经济损失。OIE将其列在15个A类动物疫病之首，我国将其排在一类动物传染病的第一位。一年四季均可发病，多发于冬、春寒冷季节[2]。

口蹄疫病毒（FMDV）具有7个血清型，分别为O型、A型、C型、亚洲1型、南非1型、南非2型、南非3型[3]，80多个亚型。病毒很容易发生变异，各型之间均无交叉免疫性，同型各亚型之间免疫力差，给FMD的防控与净化带来了困难。目前，灭活疫苗是防控FMD所用的疫苗。然而，由于灭活疫苗生产成本昂贵，需多次免疫，且存在灭活不彻底引发疫情的风险，需研发FMD新型疫苗。目前FMD新型疫苗研发工作取得了一定的进展，本文就研究情况进行综述，旨在为FMD防控提供参考。

1 亚单位疫苗

利用DNA重组技术，将编码病原微生物的抗原基因导入受体菌或细胞，使其在受体中高效表达出蛋白，提取纯化后，加入佐剂制成的疫苗，称为亚单位疫苗。焦颖等[4]利用毕赤酵母系统表达O型FMDV VP1基因，并用酵母表达的VP1蛋白免疫小鼠，然后通过ELISA检测抗体水平。结果表明，酵母所表达的VP1蛋白能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。

2 合成肽疫苗

合成肽疫苗是通过人工合成病原微生物的保护性多肽，并将其连接到大分子载体上，加入佐剂而制成的疫苗。唐华等[5]应用两种不同浓度的含 AF/72 株 FMDV VP1[131-159]、VP4[20-35]、3A[21-35] 和3B[29-42]4个抗原表位的合成肽联合CpG寡聚脱氧核苷酸(5′-TCGCGAA CGTTCGCCCGATCGTCGGTA-3′)合成肽疫苗365和364在豚鼠上进行了免疫效力评价，并设置灭活疫苗免疫组和PBS对照组。结果显示，2.5μg/只的合成肽364能保护4/5的豚鼠免受FMDV AF/72株的攻击，灭活苗组获得完全保护，其他组的保护效力仅为3/5，保护效力最高的两组的外周血CD4+T淋巴细胞含量高达33.7%和36.6%，而其他组不超过27.7%，PBS组仅为18.1%。

3 核酸疫苗

将病原基因克隆入真核表达载体上，经筛选后，获得正确的重组质粒，免疫动物后，外源病原基因可在动物机体表达，激活针对该病原的免疫应答反应，这类疫苗称为核酸疫苗。王晓虎等[6]构建了单独含FMDV VP1、VP4基因或同时含两种基因的的重组核酸疫苗，将3种核酸疫苗免疫动物后，检测免疫原性，结果显示，这3种疫苗质粒均能刺激机体产生中和抗体，且具有一定的保护效力。VP1单表达组和联合组保护率均为28.6%，共表达组和融合表达组保护率均为42.9%，灭活疫苗组保护率为100%，空载体组保护率为0。

4 表位疫苗

表位疫苗是指利用基因工程方法体外表达或人工合成病原微生物的抗原分子表位，将其作为抗原研制成的疫苗[7]。李艳丽等[8]采用FMDV衣壳蛋白VP1G-H环132～160位和C-端200～213位氨基酸序列置换猪PCV2衣壳蛋白的核定位信号序列，在大肠杆菌中表达嵌合FMDV表位的PCV2衣壳蛋白及完整的PCV2 ORF2蛋白。目的蛋白纯化后，进行复性。复性蛋白与PCV2、FMDV多克隆抗体有良好的免疫反应性。将复性蛋白加聚肌胞苷酸(Poly I:C)与ISA206制备油佐剂疫苗免疫小鼠，结果显示，复性与未复性蛋白均未能产生FMDV中和抗体，但产生了一定水平的FMDV特异性抗体。高明等[9]取O型FMDV 3个毒株VP1蛋白的优势表位，设计并合成重复串联表位基因3FoEN2，并克隆猪IgG重链恒定区基因。将2个基因依次克隆到pProEX-HTb载体，将获得的重组质粒转化感受态细胞。诱导后，经鉴定获得目的蛋白表达。分别用5种佐剂ISA206、ISA201、IMS1313、603、ISA61乳化融合蛋白配制疫苗免疫BALB/c雌鼠，并检测免疫效果。结果显示，重组蛋白能与感染O型FMDV的猪的阳性血清发生特异性免疫反应，ISA201佐剂试验组刺激机体产生的抗体水平最高。项林盛等[10]以1株O型FMDVVP1基因为模板，根据毕赤酵母密码子偏嗜性，设计合成了含有T细胞表位(21-40 aa)和B细胞表位(129-169 aa)的多肽基因TB60，构建成分泌型重组酵母表达载体pGAPZαA-TB60，线性化后，用电穿孔法转入毕赤酵母X33中，经博莱霉素筛选及PCR检测后，获得高拷贝转化子；经诱导后，该多肽能以分泌物形式在上清中表达，免疫动物后，能诱导机体产生特异性的体液免疫应答，有良好的免疫原性。

5 活载体疫苗

将外源病原基因插入到已经弱毒的活病毒或通过特定的质粒导入无毒力的细菌体内，免疫动物后，外源病原基因可在动物体内表达，这类疫苗称为活载体疫苗。李婧静等[11]根据减毒鼠伤寒沙门菌的密码子偏好性将FMDV VP1进行优化，并将其插入pYA3341载体中，获得重组质粒pYA3341-VP1，将重组质粒pYA3341-VP1依次转入减毒鼠伤寒沙门菌中间宿主X3730和表达宿主X4550中，诱导目的蛋白表达，并进行鉴定。结果表明，在重组减毒沙门菌中，表达的FMDV VP1目的蛋白大小为23ku，与预期相符。秦晓冰等[12]构建了含O型FMD结构蛋白基因的重组鸡痘病毒或疫苗，免疫BALB/c小鼠后，检测其免疫水平，结果发现，小鼠能产生较好的细胞免疫和体液免疫应答反应。王淼等[13]构建了能表达A型FMDV VP1基因的重组乳酸杆菌pSIP411-VP1-NC8和pSIP411-VP1-WCFS1，将获得的重组乳酸杆菌分别免疫豚鼠以检测免疫效果，并设置空质粒对照组pSIP411-NC8、pSIP411-WCFS1和阴性对照组，结果显示，两组重组乳酸杆菌免疫组抗体水平明显高于其他3组，差异显著，CD4+、CD8+淋巴细胞含量明显增多，脾淋巴细胞在抗原刺激后增殖明显，可在血清中检测到中和抗体。

6 基因缺失/标记疫苗

采用基因工程技术将病原毒力基因缺失，从而使病毒毒力减弱，制成的疫苗免疫动物后，无毒性，只有免疫原性，称为基因缺失疫苗，又称“标记”疫苗[14]。杨波等[15]利用反向遗传操技术构建了含组氨酸(His)标签的重组FMDV，该重组病毒能稳定表达His标签。其对BHK-21细胞和乳鼠的致病性与亲本毒株(rAsia1)类似，为新型疫苗的研制奠定了基础。袁红等[16]为研制针对我国边境地区(尤其是西南边境)流行的A型FMD(FMD)的标记疫苗储备病毒株，构建了含A型FMD疫毒P1基因的O型FMD的嵌合型质粒pO/3A91-105-AP1，NotⅠ酶切线性化后转染BSR/T7细胞，拯救得到FMDV重组病毒。间接免疫荧光、RT-PCR和序列测定结果表明拯救的FMDV为正确的A型和O型间嵌合及3Aaa91-aa105缺失的重组病毒。病毒蚀斑和一步生长曲线表明拯救病毒的感染性和复制能力稍低于其亲本病毒。

7 病毒样颗粒疫苗

体外表达的一个或多个病毒蛋白，能自动组装成与天然病毒粒子类似的空心蛋白颗粒，不含病毒核酸，不能自动组装成的复制，安全性好，免疫原性好，由此，制成的疫苗称为病毒样颗粒疫苗。董艳美等[17]根据猪源FMDV VP1上第141～160位氨基酸序列设计引物，利用重叠延伸PCR技术将该序列插入到大肠杆菌噬菌体MS2外壳蛋白基因的特定位点。然后连接到原核表达载体pET28a上，构建了重组表达质粒28a-CP-VP1，转化BL21，ITPG诱导表达得到融合表达的CP-VP1蛋白，透射电子显微镜下观察融合蛋CP-VP1成类VLPs状。间接ELISA实验证实，该蛋白能够特异地结合豚鼠抗O型FMDV的阳性血清，30μg的CP-VP1的VLPs蛋白免疫小鼠后，可以诱导其产生高效价的特异抗体。盛蓉等[18]以兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60为载体，分别在RHDV衣壳蛋白的C端、N端、306和307位氨基酸之间插入FMDV B细胞表位(VP1 200-213aa)，得到嵌合VP60基因。利用杆状病毒表达系统表达嵌合蛋白，分别命名 VP60-2F、VP60-306F 和 VP60-578F。通过电镜观察嵌合蛋白自聚为病毒样颗粒的能力，动物免疫试验结果显示，将病毒样颗粒免疫小鼠后均可产生针对VP60和B细胞表位特异的免疫应答。

8 结语

我国是世界上口蹄疫多发国家之一，且疫情复杂，这与我国的地理环境密切相关，邻国如越南、缅甸、泰国等国都有口蹄疫的暴发及流行。世界各国都很重视口蹄疫的防控工作，在国际贸易中口蹄疫是各国重点检疫的疾病。安全有效的疫苗是成功防控乃至最终消灭FMD的重要条件。随着分子生物技术的不断发展，未来FMD疫苗研发的主要方向是尽快研制价格便宜、安全性好、免疫效果好的新型基因工程疫苗。FMD基因工程疫苗研制工作也取得了令人鼓舞的成就，制备了多种FMD基因工程疫苗，但这些基因工程疫苗也存在一些缺陷，如亚单位苗与全病毒疫苗比免疫原性差，需经多次免疫才能获得有效保护。合成肽疫苗容易被细胞内的蛋白酶所降解，并且抗原位点也不一定能被所有的宿主动物识别，免疫原性较弱，使用效果并不理想。核酸疫苗长期使用后可能产生DNA抗体，对动物机体产生不良影响。表位疫苗还需要就FMDV抗原位点演变与表型间的关系进行深入研究。接种活载体疫苗后可能会因对载体病原产生相应的免疫力，干扰目的病原基因的表达，还可能造成目的基因的丢失。病毒样颗粒疫苗不易制备。可饲疫苗抗原蛋白的表达量较低。随着技术的不断发展，问题都会逐渐解决，毕竟新疫苗的研发是大势所趋。目前，商品化的FMD合成肽疫苗投放市场，对其免疫效果有待于市场进一步检验，已经通过国家新兽药临床试验审批的FMD基因工程疫苗还有复合表位蛋白疫苗、病毒样颗粒疫苗及基因缺失标记疫苗，相信未来FMD基因工程疫苗一定会替代灭活疫苗成为我国FMD防控的主力疫苗。■

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山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目(SDAIT-08-17)。