魏凤，张文通，王艳，苗立中，沈志强，

（1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600；2.山东省畜禽用蜂胶疫苗研究开发推广中心，山东滨州256600；3.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600）

鸭坦布苏病毒病实验室诊断方法综述

魏凤1,2，张文通3，王艳1，苗立中1，沈志强1，3

（1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600；2.山东省畜禽用蜂胶疫苗研究开发推广中心，山东滨州256600；3.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600）

鸭坦布苏病毒病是引起蛋鸭产蛋下降、雏鸭神经症状为主要特征的鸭重要传染病，严重危害养鸭业健康发展。正确诊断鸭坦布苏病毒病对防制该病极为关键。本文就该病病原分离鉴定、血清学诊断、分子生物学诊断三方面展开阐述，以期弄清该病诊断方面的研究进展。

鸭坦布苏病毒病；诊断方法；综述

鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu Virus,DTMUV）引起的一种以蛋鸭产蛋骤降、雏鸭出现神经症状为主要特征的传染病，该病几乎侵染所有品种的鸭，蛋鸡和鹅也有报道。临床症状主要表现为蛋鸭产蛋率的骤降甚至停产、瘫痪等；未开产蛋鸭卵泡出血、萎缩；公鸭睾丸出血、萎缩，精子质量下降、受精率低；肉鸭神经症状、脑轻度出血。自2010年4月起，在我国江苏、福建、浙江等省份陆续发生，并迅速蔓延至我国各个主要养鸭省市，给我国养鸭业造成了严重的经济损失[1]。

防制该病的关键措施之一是对该病病原的确诊。依靠对发病鸭群的病史、临床症状、剖检病变这些传统诊断方法可以进行初步诊断，但弄清病原必须依靠实验室诊断。自2010年分离出该病原以来，科研工作者对该病确诊进行了大量的研究，取得了显著成绩。本文就该病实验室诊断方法研究进展进行了如下综述。

1 病毒分离鉴定

无菌采集病鸭或病死鸭的肝脏、脾脏、肾脏、脑等病变组织样品；研磨离心后，病毒上清液用0.22μm过滤除菌；经尿囊腔途径接种9日龄SPF鸡胚，接种后48～120h鸡胚死亡；死亡高峰期集中在第4天，主要表现为绒毛尿囊膜明显增厚，胚体水肿、出血。收获死亡鸡胚尿囊液接种鸭胚成纤维细胞或DF-1细胞培养产生细胞病变，能够成功分离到DTMUV。病原的分离鉴定是检测鸭坦布苏病最准确和经典的方法，但此法受多种因素限制（比如费时费力、工作量大，需要预处理样品，对人员要求高等），不适用于快速检测。

2 血清学诊断

常用的血清学检测方法主要有中和试验、酶联免疫吸附试验和间接免疫荧光法。这些方法在临床样品的快速、早期诊断方面运用非常广泛。

中和抗体是机体受到外源病毒感染后产生的能特异性结合病毒，阻断病毒与易感细胞上的受体相结合，从而抑制病毒的入侵，使病毒失去感染能力。测定中和抗体的检测方法可分为两种：固定血清稀释病毒法和固定病毒稀释血清法。这两种方法虽然结果可靠准确，但是耗费时间长，操作过程复杂，而且特异性和敏感性都偏低，因此无法达到快速批量检测的要求。

酶联免疫吸附法（ELISA）以其快速、高通量、灵敏等特点，已广泛用于各种抗原和抗体的临床检测。ELISA分为直接ELISA、间接ELISA、双抗夹心ELISA和竞争ELISA，可根据不同的检测目的和要求灵活使用[2]。目前ELISA已成为鸭坦布苏病快速诊断的常规方法，较为常用的是间接ELISA和竞争ELISA。姬希文等以纯化的鸭坦布苏病毒分离株作为包被抗原，建立了检测DTMUV血清抗体的间接ELISA法，该方法特异性好、敏感性高、稳定性强；应用该方法检测临床鸭血清，检出率远高于琼脂凝胶扩散试验方法[3]。郝明飞等以纯化的鸭坦布苏病毒重组E蛋白作为包被抗原，初步建立了检测E蛋白抗体的间接ELISA方法，证实有较好的特异性和敏感性[4]。傅秋玲等以鸭坦布苏病毒E蛋白的主要优势抗原表位区E1蛋白作为包被抗原，建立检测鸭坦布苏病毒中和抗体效价的间接ELISA方法；利用该方法对237份来自福建省开产麻鸭的血清样品进行检测，其血清阳性率达77.9%[5]。王善辉等以鸭坦布苏病毒重组杆状病毒表达的E蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法；利用该方法对135份来自江苏省的樱桃谷鸭血清样品进行检测，发现其血清阳性率达79.3%[6]。孙敏华等以鸭坦布苏病毒NS1蛋白为包被原建立了检测鸭血清中鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法；用建立的ELISA方法检测临床鸭坦布苏病毒感染鸭及攻毒蛋鸭的55份临床血清样品，测得52份为阳性,阳性率为94.5%，对36份阴性鸭群血清样品进行检测，36份为阴性，阴性率为100%[7]。董嘉文等以纯化好的截短的DTMUVE蛋白作为包被抗原，建立了检测DTMUV血清抗体的间接ELISA方法；用建立的ELISA方法对免疫鸭坦布苏病毒灭活疫苗的鸭血清和对照鸭血清进行抗体检测，同时与攻毒保护试验进行比较，两者的阳性符合率为86.67%，阴性符合率为100%[8]。

间接免疫荧光法（IFA）：免疫荧光技术是将免疫学方法与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。在荧光显微镜下我们可检测出荧光素所发出的荧光，从而可从细胞上定位出抗原。目前为止，DTMUV抗体的检测可通过该方法来实现。但该方法操作复杂，对操作人员要求高，不适合临床快速检测[9]。

3 分子生物学检测

凭借先进的分子生物学技术和生物信息学知识，DTMUV全基因组序列已经测定完成并将完整的基因序列在NCBIGenBank中公布，科研工作者以此为基础，研制了多种针对DTMUV的分子生物学检测方法。主要包括RT-PCR、套式RT-PCR和实时荧光定量PCR。

张帅等在对DTMUV序列的比对分析的基础上，设计了1对特异性引物，通过优化PCR反应条件，建立了DTMUV的一步法RT-PCR检测方法；该方法对2010年至2011年6月份前的106份产蛋下降鸭群临床病料进行了检测,结果显示样品阳性率为46.2%[10]。王建昌等根据GenBank中登录的DTMUVE基因保守区域设计引物和探针，建立了检测DTMUV的一步法RT-PCR对20份模拟临床样品的检测结果表明，一步法RT-PCR的阳性率为75%[11]。

颜丕熙等根据鸭坦布苏病毒E基因序列，设计了2对重叠引物P1、P2和P3、P4，建立了检测鸭坦布苏病毒的套式RT-PCR方法，该套式RTPCR比一般PCR敏感性高10倍[12]。

李庆阳等根据鸭坦布苏病毒BYD-1株基因序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立了快速检测DTMUV的实时荧光定量RT-PCR方法；利用该方法分别对攻毒感染具有典型鸭新型黄病毒病临床症状和病理变化的蛋鸭的脾脏和肝脏组织进行检测,阳性率均为100%[13]。万春和等根据鸭坦布苏病毒NS5基因序列特征设计引物，建立基于SYBRGreenⅠ检测模式的实时荧光定量RT-PCR，该方法特异性好[14]。靳宇田等设计了1对特异性引物及TaqMan探针，建立了检测DTMUV的荧光定量RT-PCR方法；对来源于江苏省和安徽省的29份疑似鸭坦布苏病毒感染的病鸭组织进行荧光定量RT-PCR检测,结果有27份呈现阳性，阳性检出率为93.10%，比常规RT-PCR的敏感性高[15]。

[1]李泽君.鸭坦布苏病毒病病原的分离鉴定及生物学特性研究[J].中国家禽,2011,(17):34-35.

[2]余斌,华炯钢,刘跃生,等.鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立和应用[J].浙江畜牧兽医, 2014,(05):1-6.

[3]姬希文,闫丽萍,颜丕熙,等.鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立[J].中国预防兽医学报, 2011,(08):630-634.

[4]郝明飞,张琳,胡北侠,等.鸭坦布苏病毒包膜蛋白的原核表达和间接ELISA抗体检测方法的建立[J].动物医学进展,2012,(12):17-22.

[5]傅秋玲,陈珍,施少华,等.鸭坦布苏病毒E蛋白包被抗原间接ELISA方法的建立[J].福建农业学报,2015, (01):1-5.

[6]王善辉,谢金文,强成魁,等.鸭坦布苏病毒E基因重组杆状病毒的构建与间接ELISA检测方法的建立[J].中国家禽,2016,(01):21-24.

[7]孙敏华,郭建伟,李林林,等.检测鸭坦布苏病毒NS1抗体ELISA方法的建立[J].广东畜牧兽医科技, 2017,(01):37-40.

[8]董嘉文,李林林,孙敏华,等.鸭坦布苏病毒JM株E蛋白的截断表达及间接ELISA方法的建立[J].中国动物传染病学报,2017,(01):12-18.

[9]李国平.鸭坦布苏病毒RT-PCR诊断方法的建立与应用[J].中国畜牧兽医,2013,(01):69-72.

[10]张帅，云涛，叶伟成，等.鸭坦布苏病毒一步法RTPCR检测方法的建立和应用[J].浙江农业学报, 2012,(01):37-40.

[11]王建昌,王金凤,袁万哲,等.鸭坦布苏病毒一步法RT-PCR与荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报,2016,(08):629-633.

[12]颜丕熙,李国新,吴晓刚,等.应用套式RT-PCR快速检测鸭坦布苏病毒[J].中国动物传染病学报, 2011,(03):34-37.

[13]李庆阳,陈芳艳,刘平,等.鸭坦布苏病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].动物医学进展,2012,(07):18-22.

[14]万春和,朱海侠,施少华,等.鸭坦布苏病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量检测方法的建立[J].中国兽医学报,2013,(07):973-978.

[15]靳宇田,黄显明,许秀梅,等.鸭坦布苏病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用[J].中国动物传染病学报,2013,(04):46-50.

Review of the Diagnostic Method of Duck Tembusu Virus Disease

WEI Feng1,2,ZHANG Wen-tong3,WANG YAN1,MIAO Lizhong1,SHEN Zhi-qiang1,3,
(1.Shandong Binzhou Animal Science＆Veterinary Medicine Academe,Binzhou 256600; 2.Shandong Province Animal Propolis Vaccine Research&Development Center,Binzhou 256600; 3.Shandong LvDu Biological Technology Co,Ltd.Binzhou 256600)

Duck tembusu virus disease causes laying ducks egg drop,goose of cheeper duck neurological symptoms as the main characteristics of the duck important infectious disease, serious harm to healthy development of the duck industry.Correct diagnosis haemophilus parasuis is the key measures to control the disease.This paper described isolation and identification of pathogeny,serological diagnostics,molecular biology disease diagnosis,to understand advances in diagnosis of the disease.

duck tembusu virus disease;diagnostic method;review.□

S858.324.4+3

A

1673-1085（2017）07-0036-03

2017-06-12