李卓 朱龙有 安东善 吴春风

130021吉林省人民医院呼吸科

拟诊肺真菌病患者当中隐球菌抗原阳性率研究

李卓 朱龙有 安东善 吴春风

130021吉林省人民医院呼吸科

目的：探讨隐球菌抗原在拟诊肺真菌病患者当中的阳性率。方法：收治拟诊肺真菌病患者120例，用胶体金法测定隐球菌抗原。结果：120例患者隐球菌抗原检测阳性率3.33%，均确诊为肺隐球菌病。结论：隐球菌抗原检测明显提高了拟诊肺真菌病患者隐球菌感染的阳性率，对肺隐球菌的快速诊断具有良好的应用前景。

隐球菌；拟诊肺真菌病；抗原检测

肺隐球菌病(PC)是由新生隐球菌及其变种感染所引起的一种亚急性或慢性肺部真菌感染性疾病[1]。其临床表现无特异性，容易与肺炎、肺结核、肺癌等病相混淆，造成误诊。国内多个研究表明，PC占肺真菌病的第3位，原发性PC常见[2]。文献报告，PC多发生于免疫功能低下者，尤其是AIDS/HIV患者，其发病率为6%～10%；而在正常人群中PC发病率相对较低。国内尚未发现有相关资料报告PC在拟诊肺真菌病患者中发病率的研究。本文对2015年1月-2016年12月拟诊肺真菌病患者120例用胶体金法测定隐球菌抗原，以进一步明确PC在拟诊肺真菌病患者中的发病率。

资料与方法

2015年1月-2016年12月收治拟诊肺真菌病患者120例，诊断均符合2009年肺真菌病诊断和治疗专家共识的拟诊标准[3]。

患者资料收集：包括人口学资料、流行病学资料、主要症状及体征、基础疾病史、既往应用抗菌药物史、糖皮质激素使用史、肺泡灌洗等实验室检查资料、影像学资料等。120例拟诊肺真菌病患者中，男69例，女51例；平均年龄54.3岁；6例有饲养家禽史，1例有饲养鸽子史。入选前均发热，体温≥38℃，正在接受免疫抑制剂治疗≥30 d 2例，持续应用糖皮质激素3周8例，患有AIDS4例，体内留置导管7例，有慢性基础疾病109例(其中COPD 29例，间质性肺疾病5例，2型糖尿病44例，肝硬化3例，高血压34例)。咳嗽、咳痰57例，痰中带血3例。肺部可闻及湿啰音78例。肺部CT均有影像改变(多发结节31例，单发结节53例，单发片状浸润影5例，多发片状浸润影11例，间质性肺炎2例，混合病变18例)。所有患者均无脑膜炎症状。

主要试剂与仪器：胶体金免疫层析法试纸条为美国Immuno-Mycologics生产，美国食品药品监督管理局(FDA)批准。

胶体金免疫层析法检测：将1滴样本加入无菌试管中，取40μL血清样本混合，将隐球菌抗原检测试纸条的插入带没入样本液中，10min后读取结果。

病原体确定诊断的阳性判断标准：出现2个条带(检测条带和对照条带)为阳性；仅出现对照条带为阴性；若对照条带未出现，说明检测无效，应重新检测。

结 果

120例拟诊肺真菌病患者中，血清隐球菌抗原检测阳性4例，阳性率3.33%(4/120)，其中男3例，女1例。同时合并AIDS 1例，长期应用糖皮质激素1例，2型糖尿病伴器官损害2例。4例患者均无家禽饲养史。4例肺部影像表现3例为结节状阴影，混合病变1例。其中结节状阴影中1例为多发，2例为单发。4例患者全部在磁共振引导下行经皮肺穿刺，1例患者行气管镜检查、经支气管肺活检及肺泡灌洗。4例经病理均证实为肺隐球菌病。胶体金免疫层析检测的敏感度和特异性为100%。

讨 论

肺隐球菌病致病菌为新型隐球菌，属酵母菌[4]。新生隐球菌最早于1894年由意大利学者Sanfelice首次从桃汁中分离出[5]。它是一种条件致病菌，广泛存在于自然环境中，鸽粪分离出的新生隐球菌是人类感染的最重要来源。其他禽类，如鸡、鹦鹉、云雀等的排泄物亦能分离出隐球菌。但随后的研究发现，在城市中心、房屋内尘埃中也可检出。新生隐球菌在地球上分布广泛，甚至通过接触宠物猫、狗也可直接传播。本组120例拟诊肺真菌病患者中7例有家禽饲养史，但无一例确诊为PC，提示基础病引起的免疫功能异常和激素/免疫抑制剂的使用可能是这类患者的易患因素[6]。有研究显示，肺隐球菌病免疫功能正常的宿主年发病率0.4/10万～0.9/10万，而对于免疫功能损害者，肺隐球菌发病率明显升高，可达6%～10%。免疫功能低下主要包括感染艾滋病病毒、恶性肿瘤、使用免疫抑制药物(免疫抑制剂、激素≥10 mg 3个月等)、器官移植病史、糖尿病伴有器官损害、呼吸系统基础疾病(慢性阻塞性肺疾病、肺结核、间质性肺炎等)、粒细胞缺乏等，如出现任何一种情况，均被认为免疫功能低下。在有些患者，如高血压、冠心病、类风湿性关节炎等基础疾病亦有所体现[7，8]。本研究是针对拟诊肺真菌病患者当中隐球菌抗原阳性率研究，入组患者筛选条件与免疫功能低下标准基本相近，故可认为肺真菌病诊断和治疗专家共识所提出的宿主发病危险因素，也就是被认为免疫功能低下人群。本研究120例患者隐球菌抗原检测阳性4例(3.33%)，经病理均确诊，低于有免疫功能损害者肺隐球菌发病率的6%～10%，一方面与标本量少有关，另一方面与PC患者血清抗原检测阳性率＜40%有关。

肺隐球菌病是一种亚急性或慢性真菌感染，属于散发病，没有明显地区和种族差异，成年男性多于女性，儿童很少发病。文献提示，中国免疫功能正常的PC患者男女比例约2.5:1[9]，与本研究男女比例3:1基本一致。

肺隐球菌侵入机体的途径以皮肤和呼吸道最常见，对中枢神经系统的亲和性较高。因肺隐球菌病临床表现无特异性，而影像学亦无特异表现，因此临床上容易造成误诊。那么，检测1，3-β-D葡聚糖(G试验)和半乳糖甘露聚糖(GM试验)对诊断PC意义有多大？资料显示，新型隐球菌细胞壁中含有1，3-β-D葡聚糖较念珠菌和曲霉少，且其外面包裹了较厚的荚膜，1，3-β-D葡聚糖很难释放到血液中，所以G试验均为阴性[10，11]。目前对于肺隐球菌病实验室检查内容主要是病原学检查，主要依靠痰及血的真菌培养及墨汁染色检查，但培养和涂片阳性率低，且痰标本易污染，标本多依靠侵袭性检查获得。目前主要依靠纤维支气管镜肺泡灌洗液、经支气管肺活检、经皮肺穿刺等有创性检查来提高诊断阳性率，但有时获取标本较难。据文献报告经皮肺穿刺的确诊率74%～95%[12-14]。因临床上很多有创检查患者难以接受，因此易误诊误治，延误病情。因此就应该寻找一种简便、快速、有效、方便诊断隐球菌感染的实验方法。

目前血清学诊断方法中的胶体金法无创、操作简单，可对新型隐球菌荚多糖抗原进行半定量检测。胶体金法是一种类似于“三明治”的夹心免疫层析试纸条试验。样本稀释液和样本加入到容器中混合，再将试纸条放入，通过毛吸作用样本可层析至检测膜上的金标对照抗体处和金标抗隐球菌抗原捕获单抗处，如果样本中有隐球菌抗原，则会与金标抗隐球菌的抗体结合，该复合物在检测条带处可显示出一条可见的检测条带。对照条带处固定化的抗体将与金标对照抗体结合，形成一条可见的对照条带。阳性结果会出现2个条带，阴性结果将仅出现1个条带(即对照条带)；未出现对照条带，则该检测无效[15]。有研究显示，胶体金免疫层析法的敏感度95%，特异度100%[16]。甚至有研究认为，胶体金法比传统的血清乳胶凝集试验有更高的可信度[17]。由此可见，该检测方法在诊断新生隐球菌感染方面具有极高的特异性和敏感性，且具有在常温下性状稳定、对技术要求低、操作简单、检测时间短、结果判定简单等优点，能对拟诊肺真菌病患者的隐球菌病早期诊断提供依据，具有较高的诊断价值。胶体金免疫层析试验阳性，结合临床和典型的影像学表现，可以临床诊断肺隐球菌病[18]。部分病例连续监测结果与其病程发展相关性良好，提示该检查对病情预测具有一定意义。本研究中，抗原阳性4例，均经病理证实为PC，敏感性及特异性亦达到100%，说明其在拟诊肺真菌病患者当中进行PC筛查具有非常重要的意义。但其亦有其局限性，Vilchez等对器官移植后隐球菌感染的研究发现[19]，隐球菌脑膜炎患者脑脊液中抗原阳性率达100%，血清抗原阳性率在播散性感染为100%，隐球菌脑膜炎为86%，而单纯肺部感染者为40%，约60%的单纯PC患者仅仅通过血清抗原检测是容易被遗漏的，可见提高PC诊断阳性率的同时需采取综合检查手段才能显著提高诊断率。

总之，PC临床表现不特异，诊断往往较困难。拟诊肺真菌病患者人群亦属于免疫功能低下人群，此类患者PC发病率明显高于免疫功能正常者。有创检查往往令患者难以接受，而胶体金免疫层析法操作简单，在常温下性状稳定，检测时间短，结果判定直观，检测隐球菌荚膜抗原可快速对患者进行筛查，以达到快速临床诊断的目的。但基于其会遗漏部分PC患者，对临床上结合病史和影像检查高度怀疑PC而上述病原学检查为阴性时，还应尽早进行病理活检。

[1]赵蓓蕾,施毅,桑红.现代肺部真菌病学[M].北京:人民军医出版社,2004:134-143.

[2]刘又宁,佘丹阳,孙铁英,等.中国1998年至2007年临床确认的肺真菌病患者的多中心回顾性调查[J].中华结核和呼吸杂志,2011,34(2):86-90.

[3]中华医学会呼吸病学分会感染学组.肺真菌病诊断和治疗专家共识[J].中华结核和呼吸杂志,2007,30(11):821-834.

[4]张国,王静梅.新生隐球菌病研究进展[J].动物医学进展,2007,28(12):63-67.

[5]Kwon-Chung KJ,Fraser JA,Doering TL,etal.Cryptococeus neoformans and eryphococcus gattii,the etiologic agents of cryptococcosis[J].Cold Spring Harb Perspect Med,2014,4(7):19760.

[6]Vinicki JP,Catalan PS,Pappalardo C,et al.Invasive fungal infections in Argentine patients with systemic lupus erythematosus[J].Lupus,2013,22(9):892-898.

[7]Song JC.A case of colonic cryptococcosis[J].The Korean journalofgastroenterology=Taehan SohwagiHakhoe chi,2008,52:255-260.

[8]Li J.Duodenal cryptococcus infection in an AIDS patient:retrospective clinical analysis[J].European journal of gastroenterologyamp;hepatology,2015,27:226-229.

[9]Zhang Y,LIN,Zhang Y,et al.Clinical analysis of 76 patients pathologically diagnosed withpulmonary cryptococcosis[J].Eur Respir J,2012,40(5):1191-1200.

[10]赖国祥,张玉华,林庆安,等.国内22年肺隐球菌病回顾性分析[J].中国实用内科杂志,2005,25:176-178.

[11]Medleau L,Marks MA,Brown J,et al.Clinical evaluation of a cryptococcal antigen latex agglutination feet for diagnosis ofcryptococcosis in cats[J].J Am Vet Med Aseoc,1990,196:1470-1473.

[12]应可净,江立斌,陈恩国,等.肺隐球菌病9例分析[J].中华结核和呼吸杂志,2005,28(7):464-467.

[13]胡红杰,周畔,胡吉波,等.原发性肺隐球菌病12例临床分析[J].中华内科杂志,2006,45(9):721-724.

[14]李基根,陈龙华,高军.CT引导下经皮肺穿刺活检诊断肺隐球菌病的价值[J].放射学实践,2005,20(12):1047-1049.

[15]Lindsley MD,Mekha N,Baggett HC,et al.Evaluation of a newly developed lateral flow immunoassay for the diagnosis of cryptococcosis[J].Clinical Infectious Diseases,2011,53(4):321-325.

[16]季淑娟,倪玲红,张俊丽,等.不同荚膜抗原检测方法对隐球菌脑膜脑炎诊断和疗效评估的价值[J].中华医学杂志,2015,95(46):3733-3736.

[17]Vijayan T,Chiller T,Klausner JD.Sensitivity and specificity of a new cryptococcal antigen lateral flow assay in serum and cerebrospinal fluid[J].MLO Med Lab Obs,2013,45(3):16-20.

[18]牟向东,李若瑜,万喆,等.血清乳腺凝集试验诊断肺隐球菌病的临床对照研究[J].中华结核和呼吸杂志,2008,31(5):360-363.

[19]Vilchez RA,Fung J,Kusne S.Cryptocaccosis in organ transplant recipients:an overview[J].Am JTrensplant,2002,2:575-580.

Study on the positive rate of cryptococcal antigen in patients with suspected pulmonary mycosis

Li Zhuo,Zhu Longyou,An Dongshan,Wu Chunfeng
Department of Respiration,the People's Hospital of Jilin Province 130021

Objective:To investigate the positive rate of cryptococcal antigen in patients with suspected pulmonary mycosis.Methods:120 patients with suspected pulmonary mycosis were selected.They were determined antigen of cryptococcus by colloidal gold assay.Results:3.33%of the 120 patients were positive for cryptococcal antigen,and all of them were diagnosed as pulmonary cryptococcosis.Conclusion:The detection of cryptococcal antigen can obviously improves the positive rate of cryptococcal infection in patients with suspected pulmonary mycosis,and has a good prospect for the rapid diagnosis of cryptococcus neoformans.

Cryptococcus;Prospective pulmonary mycosis;Antigen dectection

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.33.70

吉林省卫生计生委自筹经费课题(编号：2015SZC04)

Fund projectsupported by the school of health and family planning of Jilin province(No:2015SZC04)