蒲 艳，刘 超，林 琪，李继洋，刘晓东

(新疆农业大学 农学院，农业生物技术重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830052)

基于PCR方法对载体pBluescriptⅡSK(+)及pCAMBⅠA1300 的定点突变

蒲 艳，刘 超，林 琪，李继洋，刘晓东

(新疆农业大学 农学院，农业生物技术重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830052)

运用PCR定点突变技术对载体pBluescript Ⅱ SK(+)以及植物表达载体pCAMBⅠA1300多克隆位点内相关的酶切位点进行改造，为运用CRISPR/Cas9基因编辑载体在构建敲除体系时提供更多便捷可用的酶切位点。通过酶切鉴定以及测序表明，成功将pBluescript Ⅱ SK(+)载体多克隆位点内XhoⅠ、EcoR Ⅴ、SmaⅠ、SacⅡ 4个酶切位点，分别改造为NheⅠ、MfeⅠ、NsiⅠ、PacⅠ；将pCAMBⅠA1300植物表达载体多克隆位点内的SacⅠ、SalⅠ以2个酶切位点分别改造为NsiⅠ、PacⅠ，为今后构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体及对植物功能基因进行精准定位研究奠定一定的理论基础。

pBluescript Ⅱ SK(+)；pCAMBⅠA1300；定点突变；PCR

PCR介导的体外定点突变(Site-directed mutagenesis，SDM)技术是分子生物学研究领域中的一项非常重要的技术[1]，相比传统使用化学、物理等因素的诱导导致的突变效率更高并且操作简单，为基因修饰及改造提供了另一条途径。它可以根据需要，在体外对已知序列的特定位点通过插入、缺失或替换一定长度的核苷酸序列，实现精确的改变碱基序列。它是研究分子水平、蛋白质结构及功能之间联系的非常有力的一种手段[2]。现在包括PCR介导及非PCR介导的突变技术都有所改进[3-6]，目前熟为人知的方法有大引物PCR定点突变技术[7-9]、重叠延伸PCR定点突变技术[10-11]。由于上述方法仍存在某些因素，出现突变效率低的现象，因此PCR介导的定点突变法，仅需要一步聚合酶链式反应就能对全质粒进行扩增，产生点突变。……