韩 伟，李晓敏，刘 倩，王晓玲，张晓琳

(1.国家粮食局 科学研究院，发酵生物技术组，北京 100037； 2.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122)

生物工程

微生物固态发酵和酶解工艺处理棉粕的研究

韩 伟1，李晓敏1，刘 倩1，王晓玲2，张晓琳1

(1.国家粮食局 科学研究院，发酵生物技术组，北京 100037； 2.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122)

研究了微生物和蛋白酶共同作用下棉粕中毒性因子和营养成分的变化。在枯草芽孢杆菌GJ00141、酿酒酵母GJ00079和中性蛋白酶等参与的固态发酵和酶解体系中，检测棉粕中游离棉酚、粗蛋白质、酸溶蛋白质、粗纤维、氨基酸组成、益生菌活菌数等指标。结果发现，相比原棉粕，60 h的固态发酵与酶解后，棉粕中游离棉酚含量降低40%以上，酸溶蛋白质提高了108.7%，粗纤维降低约12.7%，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母活菌数分别为7.75、7.00 lg(CFU/g)，粗蛋白质、氨基酸总量基本没有变化。由此可见，经过发酵和酶解后棉粕的营养价值和饲料品质有所提高。

棉粕；固态发酵；酶解；游离棉酚；营养成分

我国饲用蛋白资源匮乏，近年来豆粕、鱼粉等原料进口量逐年增大。与此同时，作为产棉大国，棉粕年产量超过600万t[1]。棉粕被认为是一种很好的饲用蛋白来源，粗蛋白质含量在35%～50%[2-3]。限制棉粕饲用的因素主要有两点：一是营养构成不均衡和消化率偏低；二是含有抗营养因子，如游离棉酚、环丙烯脂肪酸等[2,4-5]。

很多研究以降低游离棉酚或改良营养构成为靶点，采用微生物发酵法提升棉粕饲用价值[6-9]。例如，诸葛斌等[10]利用黑曲霉P1和枯草芽孢杆菌H1按2∶1比例混菌发酵，发酵后棉粕小肽含量可提高至18.36%，平均肽链长度可降至4.23，体外消化率可提高至88.59%；并从多肽降解效果角度说明混菌发酵优于单菌发酵。乔晓艳等[11]则利用热带假丝酵母JD-9和干酪乳杆菌MX-48发酵棉粕，发酵后棉粕中游离棉酚含量降低至270 mg/kg，脱毒率达到48.1%; 棉粕中小肽含量提高到14.43%；总氨基酸和必需氨基酸含量分别提高了10.81%和11.57%，其中赖氨酸和蛋氨酸含量分别提高了11.24%和35.48%。吴妍妍等[12]发现嗜酸乳杆菌S5菌种发酵后，棉粕中有机酸(戊酸、琥珀酸、柠檬酸)、B族维生素(B1、B2、B3、B5)、游离氨基酸(亮氨酸、苯丙氨酸)等含量分别有不同程度的显著性提高。由此可见，微生物作用有助于棉粕品质的改善。

但现有研究大多存在几点不足：一是固态发酵与酶解法结合处理棉粕的研究相对较少，且工艺细节报道不多，如加酶时间点和添加量与微生物生长的关系，发酵与酶解效果的关键指标和关键时间点，发酵终点的判断等。二是混淆益生菌和功能化微生物。很多研究将增加益生菌数量作为发酵棉粕的主要结果，忽略了不同微生物特有功能的筛选和体现，缺乏微生物数量变化和评价指标间的对应关系。三是无视不同微生物的生理特性、特有功能、生存条件要求及不同酶属性等，发酵(多种微生物)和酶解没有分成若干时间阶段加以精细过程控制。

本研究通过利用具有脱除游离棉酚作用的枯草芽孢杆菌、提高酸溶蛋白质作用的中性蛋白酶及酿酒酵母的协同作用，以棉粕为底物进行固态发酵并酶解，探究棉粕的毒性因子和营养价值变化，为评价微生物发酵棉粕源蛋白质饲料提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

棉粕，新疆泰昆集团奎屯油厂，质量指标为粗蛋白质50.27%、含油1.57%、水分8.04%、溶解度63.96%、纤维素6.71%、灰分6.47%，试验前粉碎至过10目筛。

枯草芽孢杆菌GJ00141，实验室保藏，经由游离棉酚标准品为唯一碳源的筛选体系证实，对游离棉酚有显著脱除作用；酿酒酵母GJ00079，实验室保藏，经由益生菌体外评价体系筛选；蛋白酶，活性为25 U/g；玉米粉、葡萄糖为食品级；其他试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 种子液制备

枯草芽孢杆菌GJ00141:取斜面菌种1环接于营养肉汤培养基中，37℃、200 r/min摇床培养8 h后，按0.5%比例转接至另一同样液体培养基，37℃、220 r/min 摇床或(通氧)发酵罐培养12 h，备用。

酿酒酵母GJ00079: 取斜面菌种1环接于PDA液体培养基中，30℃、150 r/min 摇床培养12 h后，按5%比例转接到另一同样液体培养基中，30℃、180 r/min 摇床或(通氧)发酵罐培养36 h，备用。

1.2.2 固态发酵与酶解工艺

原料配比见表1。添加顺序:①将棉粕、玉米粉、葡萄糖、无机盐组合投入反应器中，搅拌均匀；②将枯草芽孢杆菌GJ00141发酵液与水(25℃≤温度≤35℃、水添加量为25.00%)混合后均匀洒入发酵体系中；③发酵24 h，将酿酒酵母GJ00079发酵液与水(水添加量为3.43%)混合后均匀洒入发酵体系中，同时调节温度范围；④发酵36 h，将中性蛋白酶与水(45℃≤温度≤60℃、水添加量为2.00%)混合后均匀洒入发酵体系中；⑤发酵60 h后，发酵和酶解过程结束，干燥，得到发酵和酶解产物。

表1 原料配比 %

注：枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的有效活菌数分别为1.0×108CFU/mL和1.0×107CFU/mL；无机盐组合,包括磷酸氢二钾和磷酸二氢钠(1∶1)。

1.2.3 指标检测

粗蛋白质，参照GB/T 6432—1994方法；粗纤维，参照GB/T 6434—2006方法；游离棉酚，参照GB/T 13086—1991方法；氨基酸组成，参照GB/T 18246—2000方法；酸溶蛋白质，参照GB/T 22492—2008方法；枯草芽孢杆菌活菌数，参照GB/T 4789.2—2010方法；酿酒酵母活菌数，参照GB/T 4789.15—2010方法。

2 结果与分析

2.1 游离棉酚、酸溶蛋白质和微生物的变化

在该固态发酵和酶解体系中，枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和蛋白酶三者作用所需温度、水分、水活度、pH等条件不尽相同，故进入反应体系的时间和控制要求也不同。由于游离棉酚是棉粕中最主要的毒性因子，其含量降低主要依靠枯草芽孢杆菌GJ00141的脱除作用，所以枯草芽孢杆菌GJ00141率先被投入到反应体系中；随着枯草芽孢杆菌GJ00141进入稳定期后期和pH的降低，酿酒酵母GJ00079被投入到反应体系中；36 h后，发酵活跃期基本结束，加入中性蛋白酶进行酶解过程。

发酵体系中指标参数的变化见表2。由表2可知，0～16 h，枯草芽孢杆菌GJ00141生长代谢活跃，活菌数达到最高点8.3 lg(CFU/g)，与此同时，温度升高且游离棉酚含量迅速降低，降低约36.6%。24 h后加入酿酒酵母GJ00079，而枯草芽孢杆菌GJ00141生长代谢速度减慢，温度逐渐降低，pH、游离棉酚含量的变化趋缓。36～60 h，蛋白酶酶解阶段，酸溶蛋白质含量大幅增加，由3.68%增至7.68%，提高了108.7%；直至反应过程结束，枯草芽孢杆菌GJ00141和酿酒酵母GJ00079的活菌数分别为7.75、7.00 lg(CFU/g),游离棉酚含量降低40%以上。

表2 发酵体系中指标参数的变化

2.2 粗蛋白质和粗纤维的变化

粗蛋白质和粗纤维是评定棉粕质量的两个重要指标。固态发酵和酶解前后粗蛋白质和粗纤维的变化见表3。由表3可知，通过固态发酵和酶解，棉粕的粗蛋白质含量并没有显著增长，而粗纤维含量略有降低，从7.1%降至6.2%，降低约12.7%。由此推断，所用菌种枯草芽孢杆菌GJ00141和酿酒酵母GJ00079的发酵过程对粗蛋白质总量提高没有显著影响，蛋白质含量的高低依然取决于棉籽质量、脱壳、脱绒工序水平等；粗纤维的降低可能与微生物产生的酶类(如纤维素酶)有关，这一结果和乔晓艳等[11]报道一致。

表3 固态发酵和酶解前后粗蛋白质和粗纤维的变化 %

2.3 氨基酸组成的变化

与豆粕相比，棉粕氨基酸含量不均衡，棉粕中赖氨酸(Lys)含量低，为1.97%～2.13%，只有豆粕的50%左右，同时赖氨酸的利用率较差。故赖氨酸是棉粕的第一限制性氨基酸，但精氨酸(Arg)含量(4.65%～4.98%)远高于豆粕(只有3.4%左右)，色氨酸、甲硫氨酸含量丰富[1]。固态发酵和酶解前后氨基酸组成的变化见表4。

表4 固态发酵和酶解前后氨基酸组成的变化 %

由表4可知，通过枯草芽孢杆菌GJ00141和酿酒酵母GJ00079的固态发酵与中性蛋白酶酶解作用，棉粕的氨基酸总量在40.50%～41.76%范围间；与原棉粕相比，发酵和酶解棉粕的氨基酸总量和必需氨基酸总量均没有显著性改变(P>0.05)，而氨基酸组成发生了明显的变化，如精氨酸含量降低了1.4%～14.3%。

2.4 稳定性中试试验

为了验证本试验采取工艺的稳定性，重复进行21次、单次物料投入量250 kg的中试试验，以游离棉酚脱除率为主要检验指标。通过固态发酵和酶解，游离棉酚降至330～575.5 mg/kg之间；测量值中位数对比中，游离棉酚脱除率为51.2%；且固态发酵和酶解产物形态良好。由此可推测，本试验工艺复现性好，易于工业扩大化推广。

3 结 论

本试验研究了在枯草芽孢杆菌GJ00141、酿酒酵母GJ00079和中性蛋白酶等参与的固态发酵和酶解体系中棉粕的毒性因子和营养成分的变化。结果发现：经过60 h的处理，相比于原棉粕，固态发酵和酶解后的棉粕中游离棉酚含量降低40%以上，酸溶蛋白质含量提高了108.7%，粗纤维含量降低了12.7%，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母活菌数分别为7.75、7.00 lg(CFU/g)，pH降至5.0左右，呈酸香味；而粗蛋白质、氨基酸总量基本没有变化。并在中试试验中重复该工艺，以游离棉酚脱除率为衡量指标，棉粕的发酵和酶解效果稳定。综上所述，使用发酵和酶解工艺能够稳定地提高棉粕的营养价值和饲料品质。

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Treatment of cottonseed meal by solid-state fermentation and enzymatic hydrolysis

HAN Wei1, LI Xiaomin1, LIU Qian1, WANG Xiaoling2, ZHANG Xiaolin1

(1.Fermentation Biotechnology Group, Academy of State Administration of Grain, Beijing 100037,China;2.School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China)

The changes of toxic factors and nutritional components in cottonseed meal treated by solid-state fermentation and enzymatic hydrolysis were studied. The free gossypol, crude protein, acid soluble protein, crude fiber, amino acid composition and viable count of probiotics were determined in the system of solid-state fermentation and enzymatic hydrolysis participated byBacillussubtilisGJ00141,SaccharomycescerevisiaeGJ00079 and neutral proteinase. The results showed that compared with the original cottonseed meal,after solid-state fermentation and enzymatic hydrolysis for 60 h, the contents of free gossypol and crude fiber decreased by more than 40% and 12.7% respectively, the acid soluble protein increased by 108.7%, the viable count ofBacillussubtilisandSaccharomycescerevisiaewere 7.75, 7.00 lg(CFU/g) respectively, and the contents of crude protein and total amino acid unchanged. Therefore, the nutritional value and feed quality of cottonseed meal were improved by fermentation and enzymatic hydrolysis.

cottonseed meal; solid-state fermentation; enzymatic hydrolysis; free gossypol; nutritional component

2016-05-30；

2016-10-27

国家粮食局科学研究院自主选题科研计划课题(ZX1505)

韩 伟(1983)，男，助理研究员，硕士研究生，研究方向为工业微生物(E-mail)hw@chinagrain.org。

张晓琳，教授(E-mail)zxl@chinagrain.org。

S816;TQ92

A

1003-7969(2017)01-0112-04