霍志鹏，王 玉，周水平，冯 锋

(1. 天士力控股集团研究院，天津 300410； 2. 创新中药关键技术国家重点实验室，天津 300410； 3. 中国药科大学，南京 210009)

黄连生物碱成分的HPLC-DAD-MS分析

霍志鹏1,2，王 玉1,2，周水平1,2，冯 锋3

(1. 天士力控股集团研究院，天津 300410； 2. 创新中药关键技术国家重点实验室，天津 300410； 3. 中国药科大学，南京 210009)

目的：优化测定黄连中生物碱成分的高效液相色谱法条件，并用LC-MS鉴定黄连中主要生物碱类成分。方法：使用Zorbax SB C18色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为水溶液(含20 mmol/L乙酸铵和0.5%乙酸)，梯度洗脱，检测波长345 nm。联用电喷雾-离子阱质谱检测器鉴定主要色谱峰的成分。结果：建立了测定黄连中黄连碱、巴马汀和小檗碱三个成分含量HPLC方法，黄连碱、巴马汀和小檗碱的线性范围分别为0.042 0～0.840 μg、0.044 8～0.896 μg和0.050 2～1.004 μg；LC-MS鉴定了黄连中7个色谱峰。结论：该方法简便、准确、可靠，能用于控制黄连药材及饮片的质量，同时该方法使用溶解性好、易挥发的乙酸铵代替十二烷基硫酸钠(SDS)做离子对试剂，适用于LC-MS分析。

黄连，高效液相色谱，黄连碱，盐酸巴马汀，小檗碱

黄连为毛茛科植物黄连(CoptischinensisFranch)、三角叶黄连(CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao)或云连(CoptisteetaWall) 的干燥根茎[1]，黄连中的主要活性成分原小檗碱类生物碱为季铵类生物碱。采用RP-HPLC测定黄连中生物碱类成分含量时，小檗碱类在C18为填料的色谱柱上保留行为较差，通常需在流动相中加入离子对试剂改善保留行为，常用的离子对试剂为十二烷基硫酸钠(SDS)[1, 2]，SDS有分子量大、难挥发不适用于LC-MS分析、易析出堵塞管路等缺点[2, 3]，有文献在用三乙胺调节流动相pH值后LC-MS法分析黄连中生物碱[4]，但三乙胺进入质谱系统后残留时间较长，很难清除。本实验用分子量小、溶解性好、易挥发、质谱中易清除的乙酸铵做HPLC流动相中的离子对试剂，建立了同时测定黄连中3个主要生物碱类成分的方法。测定了5批黄连药材的含量，并采用HPLC-ESI-MS联用方法鉴定了黄连中的主要生物碱类成分。以期为黄连及含黄连制剂质量控制提供参考。

1 材料与仪器

1.1 试药 盐酸小檗碱对照品和盐酸巴马汀对照品(均购于中国药品生物制品检定所，批号分别为110713-200609和110732-200506)，盐酸黄连碱对照品(南京泽郎科技有限公司，批号200803)；乙腈为色谱纯；乙酸铵、冰乙酸、甲醇为分析纯；二纯水为MilliQ纯化水系统制备；黄连药材(20101001)、黄连药材(20101201)分别由天津天士力现代中药资源有限公司采购自重庆石柱，经中国药科大学冯锋教授鉴定分别为黄连(CoptischinensisFranch)和三角叶黄连(CoptisdeltoideaC Y Cheng et Hsiao)；姜黄连(20101202)、酒黄连(20101203)、萸黄连(20101204)三种炮制品为黄连药材(20101001)在天津市兴达中药材加工厂炮制加工而成。

1.2 仪器 BP-110S型电子天平(Sartorius)，Milli-Q超纯水系统(Millipore)，1100型高效液相色谱仪(Agilent)，LC/MSD Trap system(Agilent)， Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱(Agilent)，IKA-MF10型粉碎机(IKA)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 流动相A为乙腈，流动相B为20 mmol/L乙酸铵-0.5%醋酸水溶液，流速1.0 ml/min，梯度洗脱：0 min (A 10%)→10 min (A 15%)→15 min (A 28%)→30 min (A 32%)→35 min (A 32%)，分析时间为35 min，每次进样前用A 10%平衡10 min，柱温30 ℃，检测波长为345 nm[2]。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液配制 精密度称取对照品适量，加甲醇配制成每ml含42.0 μg盐酸黄连碱、44.8 μg盐酸巴马汀和50.2 μg盐酸小檗碱的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶制备 黄连药材或饮片粉碎后过二号筛，精密称取约0.20 g药材粉末，置具塞锥形瓶内，精密加入50 ml甲醇-盐酸(100∶1)溶液，称定重量，密塞，超声30 min(功率250 W，频率40 kHz)，放冷，加甲醇-盐酸(100∶1)溶液补足失重，摇匀，滤过，精密移取5.0 ml续滤液至50 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.22 μm)滤过，即得[1]。

2.3 系统适应性试验 分别吸取混合对照品、供试品溶液10 μl，按“2.1”项下色谱条件检测。对照品和供试品的色谱图见图1。结果显示，盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱色谱峰的理论塔板数均不低于34 927；供试品中盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱与相邻色谱峰的分离度分别为2.87、6.49和3.85，三个成分的分离度良好。见图1。

1.盐酸黄连碱 2.盐酸巴马汀 3.盐酸小檗碱

2.4 标准曲线的制备 分别精密吸取混合对照品溶液1、2、5、10和20 μl，按“2.1”项下色谱条件检测，以对照品进样量(X，μg)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，线性方程见表1。

表1 三个生物碱的标准曲线

2.5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μl按“2.1”项下色谱条件检测，重复进样6次，6次进样峰面积的RSD黄连碱为0.87%，巴马汀为0.91%，小檗碱为0.91%；出峰时间的RSD黄连碱为0.02%，巴马汀为0.02%，小檗碱为0.03%，方法精密度良好。

2.6 稳定性试验 称取黄连粉末(批号20101001)0.2 g 按“2.2.2”项下方法制得供试品溶液，分别于0、2、4、8、16和24 h进样10 μl，6次进样峰面积的RSD黄连碱为1.21%，巴马汀为1.13%，小檗碱为1.06%，黄连供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取黄连粉末(批号20101001)6份，按上述供试品制备方法和HPLC方法检测，6次含量测定得到3个成分含量的RSD黄连碱为2.34%，巴马汀为1.90%，小檗碱为1.33%。

2.8 加样回收率试验 精密称取对照品适量，加甲醇-盐酸(100∶1)溶液配置成每ml含0.055 2 mg盐酸黄连碱、0.036 2 mg盐酸巴马汀和0.128 6 mg盐酸小檗碱的加标对照品溶液，精密称取约0.10 g黄连药材粉末加入锥形瓶，精密加入上述加标对照品溶液50 ml，按“2.2.2”项下方法从“称定重量，密塞”起制备加标供试品溶液，平行6份，按上述方法检测，计算回收率。盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的平均回收率依次为98.7%、97.6%和102.3%，RSD依次为2.47%、2.10%和1.62%。

2.9 样品测定 取黄连药材两批，3种黄连炮制品各一批，每批样品平行两份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件检测。黄连药材及黄连三种炮制品的生物碱含量测定结果见表2，可见各样品的生物碱含量差异较小，炮制对样品中生物碱含量无明显影响。

2.10 LC-DAD-ESI-MS分析方法 液相分析条件同“2.1”项，DAD检测器记录190～400 nm紫外吸收光谱；离子化方式为电喷雾离子化(ESI)，干燥气体N2，流量12 L/min，雾化器压力50 psi，脱溶剂干燥温度350 ℃，质谱检测器为离子阱检测器(Ion-Trap)，扫描范围：m/z50～1 100。

表2 黄连及不同炮制品的生物碱含量

注：表中各生物碱的含量为以其盐酸形式计算得到

2.11 LC-MS检测样品处理 称取黄连粉末10 g，加入150 g纯化水，称定重量，加热回流提取30 min，冷却至室温，加入纯化水补足失重，滤纸过滤，精密移取续滤液1 ml置50 ml量瓶中，加纯化水定容至刻度，用微孔滤膜(0.22 μm)滤过，即得样品溶液。取样品溶液10 μl按“2.10”项下方法检测。

2.12 LC-DAD-ESI-MS检定黄连中成分结果 样品的紫外吸收色谱图和总离子图见图2和图3，本实验中的HPLC方法对黄连中物质的分离度和峰形良好。对主要色谱峰190～400 nm的吸收特征分析显示黄连中7个峰分为两类，1号峰(λmax=270，305 nm)吸收特征与木兰花碱的吸收特征相似；2～7号峰分别在255～270 nm和345～360 nm之间有两个最大吸收带，吸收特征与小檗碱相似，见图4。根据各高效液相色谱峰的紫外吸收和质谱裂解规律，从7个色谱峰中鉴别出8个成分，见表3，包括一个阿朴啡类生物碱和7个原小檗碱类生物碱。

图2 黄连水煎液UV图(345 nm)

图3 水提样品的总离子流图

图4 1号峰和7号峰的紫外吸收图

峰号化合物名分子离子峰m/z离子碎片m/zUVλmax(nm)1木兰花碱342319，297，282，265，237220，270，3052四脱氢碎叶紫堇碱322307，292，279230，260，3573非防己碱338．2323，308，294，280230，262，3454表小檗碱336320，308，292，278240，270，345药根碱338323，294240，270，3455黄连碱320292，290，276，262，249238，255，3586巴马亭352337，322，308，294227，270，3457小檗碱336321，320，306，292，278230，262，346

图5 峰1的质谱图

峰1，[M]+为342，[M-H+Na]+为364，有297 [M-CH4-NHCH2]+，282 [M-CH4-NHCH2-CH3]+，265[M-CH4-NHCH2-CH3-OH]+，237[M-CH4-NHCH2-CH3-OH-CO]+等离子碎片，见图5。结合文献报道的裂解规律和最大紫外吸收[5, 6]，可确定该峰为木兰花碱[C20H24NO4]+，木兰花碱的质谱裂解规律见图6。

图6 木兰花碱的质谱裂解规律图

峰7，[M]+的m/z为336，有321 [M-CH3]+，320 [M-CH3-H]+， 306 [M-CH3-CH3]+，292 [M-CH3-H-CO]+，278 [M-CH3-CH3-CO]+等离子碎片，见图7。峰7的分子量和小檗碱的分子量相同，根据文献[7]报道的裂解规律和标准品比对确定该峰为小檗碱[C20H18NO4]+。小檗碱的断裂规律见图8，原小檗碱类化合物为同一母核，与小檗碱的断裂规律相似。

图7 峰7的质谱图

图8 小檗碱的质谱裂解规律

峰2，[M]+的m/z为322，有307 [M-CH3]+，292 [M-CH3-H-CH2]+，279 [M-CH3-CO]+,根据文献报道[7]的裂解规律鉴定为四脱氢碎叶紫堇碱(Tetradehydrocheilanthifoline) [C19H16NO4]+。峰3，[M]的m/z为338，有323 [M-CH3]+，308[M-CH3-CH3]+，294[M-CH3-H-CO]+，280 [M-CH3-CH3-CO]+等碎片离子，根据文献[7]报道鉴定为非防己碱[C20H20NO4]+。

峰4为两个化合物共出峰，[M]+的m/z分别为336和338，峰4的主要的离子m/z为336，其二级离子谱显示该离子有320 [M-CH3-H-CO]+，308 [M-CO]+，292 [M-CH3-H-CO]+，278 [M-CH3-CH3-CO]+等离子碎片，该分子离子峰与小檗碱分子量相同，断裂规律与小檗碱相似，但出峰时间不同，鉴定为表小檗碱[C20H18NO4]+。在峰4的后半部分出现m/z338的离子，二级离子谱显示该分子离子有323 [M-CH3]+，294 [M-CH3-H-CO]+等离子碎片，根据文献[7]报道的裂解规律确定该分子离子为药根碱[C20H20NO4]+。

峰5，[M]+的m/z为320，有292 [M-CO]+，290 [M-CH2O]+，277 [M-CH2O-CH]+，262 [M-CH2O-CO]+，249[M-CH2O-CH-CO]+等离子碎片，根据文献[7]报道的裂解规律确定该峰为黄连碱[C19H14NO4]+。峰6，[M]+的m/z为352，有337[M-CH3]+，322 [M-CH3-CH3]+，308 [M-CH3-H-CO]+，294 [M-CH3-CH3-CO]+等离子碎片，峰6的分子量和巴马汀相同，根据文献[7]报道的裂解规律确定该峰为巴马汀[C21H22NO4]+。黄连中原小檗碱类生物碱的母核见图9。

图9 黄连中原小檗碱类生物碱的母核

峰号 成分M+R1R2R3R42四脱氢碎叶紫堇碱322-H-CH3-CH2-3非防己碱338-CH3-H-CH3-CH34表小檗碱336-CH3-CH3-CH2-药根碱338-H-CH3-CH3-CH35黄连碱320-CH2--CH2-6巴马亭352-CH3-CH3-CH3-CH37小檗碱336-CH2--CH3-CH3

实验中建立的分析方法能简便、快速的鉴定黄连中的生物碱成分，证实了本文中用对照品对比得到的峰归属，为黄连药材及含黄连的中药复方制剂的成分分析和含量控制提供了可靠的实验基础。本实验的方法对黄连中生物碱有良好的分离度和质谱响应，可能在黄连生物碱的药物代谢分析上有很好的适用性。

3 讨论

2010版《中国药典》黄连含量测定项中流动相需添加0.4%SDS做离子对试剂[1]，SDS在流动相中的溶解性对温度和有机相比例敏感，温度降低或流动相比例发生变化都有可能析出堵塞管路[2, 3]， SDS具有对C18填料有改性作用、难挥发、不适合LC-MS分析等局限。本实验使用分子量小、溶解度好、易挥发的乙酸铵代替SDS改善生物碱的分离度和峰形，可以避免以上问题。

实验中比较了等度洗脱与梯度洗脱，梯度洗脱分离度较好；还比较了20 mmol/L醋酸铵，与100 mmol/L醋酸铵的区别，两个浓度的分离度和线性范围无显著区别，所以选择盐浓度较低的20 mmol/L醋酸铵作为离子对试剂，使用梯度洗脱方法。

本实验建立的方法能同时测定黄连中小檗碱、巴马汀和黄连碱3个主要成分的含量。方法学考查结果显示，该方法稳定、可靠，可用于黄连及黄连炮制品质量的控制和评价。实验中还用HPLC-MS对黄连样品进行了分析，通过质谱数据得到的峰归属结果与标准品比对相附，黄连药材样品中5、6、7号峰为纯物质峰，进一步证明了本实验中色谱方法的准确性。相对于前人用醋酸-醋酸铵改善黄连生物碱分离效果的研究[7]，本方法分离度和峰形均有较大的改善，并测定了含量相对较多的黄连碱的含量。

本实验的方法比2010版《中国药典》中黄连项少测定了一个表小檗碱成分；但小檗碱、巴马亭和黄连碱均为黄连中含量较多的生物碱，3个生物碱的含量之和占了黄连生物碱中的大部分，控制这3个成分的含量也能在很大程度上保障黄连及含黄连制剂的质量。并且有多数含黄连的复方制剂在黄连生物碱中只需要控制小檗碱的含量。本实验的方法有很大的应用空间。

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2 武小赟,李铁钢,阳勇,等. HPLC法测定黄连中主要生物碱的方法学研究[J]. 上海中医药杂志,2010,44(6):112-115

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7 Chen J，Wang F，Liu J，etal. Analysis of alkaloids in Coptis chinensis Franch by accelerated solvent extraction combined with ultra performance Liquid chromatographic analysis with photodiodearray and tandemmass spectrometry detections[J]. Analytica Chimica Acta,2008,613(2):184-195

Huo Zhipeng1,2, Wang Yu1,2, Zhou Shuiping1,2,Feng Feng3

(1. Tasly Academy, Tasly holding Group Co Ltd, Tianjin 300410;2. State Key Laboratory of Innovative Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300410;3. China Pharmaceutical University,Nanjing 210009)

Objective： To optimize the RP-HPLC method for assaying the alkaloids inRhizomaCoptidis, and indentify main alkaloids by LC-MS. Method： A Zorbax SB C18column was used. Mobile phases A and B were acetonitrile and water solution with 20 mmol/L ammonium acetate and 0.5% glacial acetic acid. Gradient elution was employed for separation. The detecting wavelength was 345 nm. ESI-IonTrap mass detector was attached to the system for identifying of chromatography peaks . Results： The linear range of copsitine hydrochloride, palmatine hydrochloride and berberine were 0.042 0～0.840 μg, 0.044 8～0.896 μg and 0.050 2～1.004 μg, respectively. Seven compounds were identified by the method. Conclusions： The HPLC method established was simple, accurate and reliable, and can be used in quality control ofRhizomaCoptidis.

RhizomaCoptidis， HPLC-MS， copsitine hydrochloride， palmatine hydrochloride， berberine

2016-01-27

国家“重大新药创制”科技重大专项(No.2010ZX09401-406)

R927

A

1006-5687(2016)02-0008-05