俞春英，沈晓霞，沈宇峰，孙 健

(浙江省中药研究所有限公司，浙江 杭州 310023)

蛇足石杉的研究进展

俞春英，沈晓霞*，沈宇峰，孙 健

(浙江省中药研究所有限公司，浙江 杭州 310023)

对蛇足石杉的资源分布、生物学特性、化学成分、繁殖技术和栽培种植方面的研究成果进行总结分析。

蛇足石杉； 石杉碱甲； 繁殖

蛇足石杉(Huperziaserrata(Thunb. ex Murray) Trev.)为石杉科石杉属草本植物。《全国中草药汇编》称为千层塔，是蛇足石杉的药材名，各地别名有蛇足草、金不换、千金榨等，畲药名为石壁果果。蛇足石杉以干燥全草入药，味苦、辛、微甘，性平，小毒，归肺、大肠、肝、肾经，具有清热解毒、生肌止血、散瘀消肿等功效[1]。现代研究表明，蛇足石杉中含有的石杉碱甲[2-3]是一种高效胆碱酯酶抑制剂[4]，具有治疗重症肌无力、中老年痴呆,以及提高记忆力、空间思维能力、结构推理能力等方面的作用[5]。优点为作用时间长，安全指数大，稳定性好，不良反应小等。目前的石杉碱甲类药物的生产，依然以野生蛇足石杉为原材料，在提取率为100% 的情况下，提取1 kg的石杉碱甲，需消耗掉将近 10万 kg的蛇足石杉。资源的短缺使得药材价格暴涨，据统计，纯天然石杉碱甲提取物在国际市场上的交易价格已到达50万美元·kg-1[6-7]。自然条件下，蛇足石杉植株矮小，生长十分缓慢，年生长量仅 2.0～3.0 cm[8]，难以满足市场需求，因此保护野生蛇足石杉资源已是当务之急。现对近年来有关蛇足石杉的资源分布、生物学特性、化学成分、繁殖技术和栽培种植方面的研究成果进行系统的综述。

1 资源分布情况

1.1 概况

蛇足石杉生于海拔300～2 700 m的林荫湿地下、灌丛下、路旁或沟谷石上。全国除西北地区部分省区、华北地区外均有分布。亚洲其他国家和地区如日本、朝鲜半岛、东南亚、南亚、太平洋地区、俄罗斯、大洋洲、中美洲亦有[9]。

1.2 国内分布情况

蛇足石杉是一种广泛分布于林下的小型草本植物，受上层植物遮盖，在野外环境中很难精确地确定数量和生物产量。为更好地反映国内蛇足石杉资源状况和天然生物量及可采量，吴荭等[10]在湖北(武当山、高岚)、湖南(张家界、衡山)、广西(桂林、大瑶山)、广东(大明山、鼎湖山、灵霄山)、贵州(梵净山、白水)、云南(南涧、峨山、文山、昆明)、浙江(天台、临安、平阳、乐清、杭州)、江西(井冈山、庐山)、福建(武夷)、河南(信阳)、四川(都江堰、峨眉山)、重庆、藏南东喜马拉雅山等12省、区展开了野外实地调查，结果发现多数蛇足石杉的分布地位于风景区和自然保护区内，并初步确定我国蛇足石杉天然生物量为4 656.6 t，理论可采量为1 604 t，商业可采量不超过200 t。由此可见野生资源蕴藏量及商业可采量已经不能满足日益增长的需求。

2 生物学特性

2.1 植物形态学

蛇足石杉是多年生蕨类植物[11]，株高10～30 cm，茎直立或下部平卧，具2叉分枝，顶端有时有芽胞，落地可生根成新苗，但在野外，生殖芽繁殖的现象极少。叶螺旋状排列，具短柄，椭圆披针形，长1～2 cm，宽3～4 mm，基部楔形，边缘有不规则的尖锯齿，两面光滑，有光泽，中脉突出明显，薄革质。

孢子叶与不育叶同行，孢子囊生于叶腋，肾形，黄色，孢子[9-11]成熟时裂开，为淡黄色粉末。孢子萌发后，形成配子体(原叶体)。成熟的配子体为不规则的块状体，贴于土表层，通过菌根汲取营养。配子体产生的精子和卵子在水的环境下受精，发育成胚，暂时寄生在配子体上，长大后配子体死亡，孢子体即独立生活。整个生长周期长达8～10年。

2.2 显微特征

中国植物志根据植物分类学将蛇足石杉划分在蛇足石杉组，蛇足石杉组[9]中有皱边石杉、昆明石杉、四川石杉、亮叶石杉等12种石杉属植物，其中只有蛇足石杉是中药材千层塔的基源，为确保药材基源的准确性，除了通过对植物形状、大小等外观鉴定外，还采用显微技术进行鉴定。

根据内部结构[12]以及显微特征发现蛇足石杉的根只具初生结构，分为表皮、皮层和维管柱3个部分。分生区先端具有3个大型的薄壁细胞，起着支撑和保护作用，成熟区没有根毛，被真菌代替，通过真菌吸收养分。茎中的薄壁组织是茎的主要组成部分，生物碱结晶位于内外皮层间的薄壁细胞中，茎中的叶绿体位于近表皮的部分薄壁细胞中，说明茎也能进行光合作用。叶由表皮、叶肉、叶脉组成。叶上下表皮均有气孔分布，以下表皮居多，生物碱结晶位于上表皮细胞内。叶肉细胞呈等径形，内含大量叶绿体，可进行光合作用。生物碱主要存在于根的中柱木质部和茎的皮层薄壁细胞中，少数存在于叶肉细胞及其胞间隙中，含量大小顺序为叶≈根>茎[13]。

关于蛇足石杉孢子的大小、形状及表面纹饰，涂冬萍等[14]收集了广东省6个县的野生蛇足石杉资源，利用电镜扫描，发现各居群的蛇足石杉孢子一般具有固定的轮廓及表面纹饰，孢子形态均为四面体型，辐射对称，三裂缝，上被白色颗粒物，赤道面观为近半圆或扇形，极面观为钝三角形，孔穴纹饰，有四分体痕。说明蛇足石杉的孢子受环境影响较小，但不同居群的孢子在极轴长、赤道轴长、极赤比、孔穴密集程度、裂缝形态及辐射区形态上有差异，这些可作为蛇足石杉资源多样性的佐证。

3 生物碱成分研究及石杉碱甲合成

3.1 生物碱成分

早在1881年，有学者已经开始对蛇足石杉生物碱的研究，但直到1940年这方面的工作才得到广泛的开展。1950年末到1960年初陆续揭示出其所含生物碱的结构。20世纪80年代，上海药物研究所刘嘉森[15]从蛇足石杉中分离石杉碱甲，化学名称(5 R，9 R，11E)-5-氨基-11-亚乙基-5，8，9，10-四氢-7-甲基-5，9-亚甲基环辛四烯并(b)吡啶-2-(1 H)-酮)和石杉碱乙。两者都具有很强的抑制胆碱酯酶活性作用，特别是石杉碱甲，引起了国内外科学家们的广泛关注，目前从中分离鉴定的生物碱已达到90多种[16]。

近年来，蒋金和等[17]首次从云南屏边产的蛇足石杉中通过溶剂提取、硅胶柱层析等方法分离鉴定出11个化合物，6个生物碱分别为石杉碱甲、石杉碱乙、石杉碱庚、马尾杉碱乙、8β-羥基马尾杉碱乙、Iycoposerramine D，3个萜分别为serratenediol、21-episerratenediol、serratenediol-3-acetate和2个甾体分别为β-谷甾醇和胡萝卜甙。郑凯凯[18]等利用硅胶、反相硅胶、Sephadex HL-20等柱色谱进行分离纯化，通过磁核共振、质谱等谱学数据鉴定化合物结构，共分离得到11个化合物，10个为石杉型三萜类化合物，1个为二苯并呋喃醇类化合物，并发现了1个新化合物—千层塔型香豆酸酯。

3.2 石杉碱甲提取与合成

石杉碱甲在蛇足石杉的含量仅为1/10万，提高提取率及优化化学合成石杉碱甲都是有效的途径。

石杉碱甲的提取工艺较多应用酸浸取、高效液相色谱、硅胶柱层析等分离法。以蛇足石杉为原料[19]，采用生物碱分离的传统办法，石杉碱甲的提取率能达到79.4%以上。张卫刚等[20]采用分析法对蛇足石杉中的石杉碱甲提取工艺进行优化，在乙醇浓度为90%，乙醇倍量7倍量，氨水调pH值9的条件下石杉碱甲的提取率为89.26%。

通过构建三碳桥环结构是合成石杉碱甲的关键[21]，近20年来石杉碱甲的合成从最初阶段的消旋化合成到手性合成，反应步骤逐步减少，立体选择性和总效率的不断提高，都体现了合成领域的发展。但人工合成的石杉碱甲均有一定的局限性[22-23]，原料化合物的多步合成，催化剂配体的定制合成，提高了合成成本；合成的石杉碱甲中副产物较多，纯度不够；以及合成过程中产生的叠氮磷酸二苯酯，在工业化生产中存在危险性等等。由于石杉碱甲的生物活性极其有限的天然资源，国内外药物化学工作者对石杉碱甲的合成，类似物及衍生物的合成，做了大量工作，至今仅有个别类似物能达到天然石杉碱甲的活性[24]。

蛇足石杉植株内含有丰富的内生真菌，近年来，不少科学家尝试从其内生菌的次级代谢产物中提取石杉碱甲，韩文霞等[25]采集了四川的野生蛇足石杉，经内生真菌分离纯化后再经液体发酵，筛选出了尖镰孢(镰刀菌)，其发酵液中石杉碱甲含量为11.1 mg·L-1，还远远达不到商业化生产的要求。

4 组织培养技术和扦插繁殖技术

4.1 组织培养技术

组织培养如以蛇足石杉的茎尖为外植体，采用不同浓度的次氯酸钠溶液、升汞溶液，经过多次灭菌，仍然很难解决茎尖污染问题。在刮去表皮的茎段的试验中发现，内源真菌[26]存在于茎段的皮层，至少在表皮组织内。

为探讨蛇足石杉中的内生真菌含量是否会随季节变化而变化，汪学军等[27]分别采收8月、10月以及次年2月的蛇足石杉植株进行内生菌研究，结果发现2月收集的蛇足石杉内生真菌数量最少，为外植体的选择提供了依据。刘江海等[28]以蛇足石杉活体茎尖为外植体，利用多种消毒剂进行表面消毒以及用孔雀石绿、原子吸收光谱联合杀灭内生真菌，得到无菌苗二叉分枝，经4次二叉分枝继代培养后，得到数量不等的侧芽，最多的植株可产生14个侧芽，但侧芽拨离、接种后死亡率较高。蛇足石杉茎尖诱导丛生芽和绿色小体的试验[29]中发现最为适宜的蔗糖浓度为2%和4%，平均每团绿色小体可分化出16株丛生芽。

在自然条件下，蛇足石杉的繁殖方式主要是孢子繁殖和芽胞繁殖，但萌发较为困难。骆冰洁等[30]在蛇足石杉芽胞萌发的试验中发现将芽胞接种于Moore培养基，暗培养，温度为(22±2)℃，芽胞的萌发率较高。韦景枫等[31]以孢子囊为外植体，在0.1%的氯化汞灭菌4～5 min，污染率高达93.5%，说明孢子囊内部可能也存在丰富的内生真菌。孢子在1/2 MS+GA35 mg·L-1的培养基上培养，培养温度控制在25～28 ℃，219 d后孢子萌发。包日双[32]以孢子囊为外植体得到蛇足石杉的原叶体，原叶体在无激素的MS培养基培养60 d后，增殖倍数达到131.1。培养90 d后，孢子体诱导率为4.0%，其中以11—12月采收的孢子萌发率较高。

4.2 扦插繁殖技术

蛇足石杉植物中内生真菌的存在，给组织培养技术带来了巨大的困难，扦插繁殖技术成为另一条大量繁殖蛇足石杉的途径。选取5～8 cm的健壮顶芽插条，经不同浓度的萘乙酸、吲哚丁酸、生根粉浸泡[33]，扦插于腐殖土与河沙的混合土壤的基质中，其中以2 000 mg·L-1吲哚丁酸处理后的插条效果最好，2次观察的发根率为90%～100%。龙华等[34]认为，6 cm的插条在萘乙酸质量浓度为20 mg·L-1中浸泡5 min,90 d后的成活率达到90%。覃大吉等[35]研制的蛇足石杉NFT扦插育苗技术中，以1 000 mg·L-1吲哚丁酸+1/8 MS无机营养液，98 d后，插条生根率达到98%。

5 栽培技术

解决人工培植技术难题的重要前提是充分了解蛇足石杉天然居群的生态因子及居群特点。从野生蛇足石杉分布来看，海拔分布相对较广，从50 m到2 700 m的山地密林下或沟谷阴湿土均有分布。居群环境具空气湿度大，年均降水量和郁闭度高等特点[9-10]。

根据蛇足石杉[36-37]自然群居结构、原生境土壤养分、酸碱度及空气温湿度等的调查测定发现，自然群居结构分为集中分布居群、分散分布居群2种。其中集中分布居群主要由幼苗和幼株构成，占居群植株的80%左右，更新能力较强，但要注意植株间的距离，避免过密导致幼苗的死亡，减弱其更新能力。

pH值为4.75～5.31的偏酸性土壤有利于蛇足石杉集中分布居群的形成[38-39]，且蛇足石杉对K、Ca、Zn和Na的需要程度较高，对Pb、Cu、Cd 3种重金属元素的富集能力较强，在人工栽培中应注意协调各元素的合理配给，注意土壤酸碱度的调控。

适宜的温度[40]是蛇足石杉生长发育的必要条件，过高或过低的温度胁迫会抑制植物的整个发育过程。分别在25、30、35、40 ℃的温度处理蛇足石杉，通过测定叶片中的可溶性糖、可溶性蛋白质、游离脯氨酸含量及超氧化物歧化酶、过氧化物酶的活性，并对其进行相关性分析，表明蛇足石杉适宜生长温度在25～30 ℃，持续35 ℃对生长有明显的影响，40 ℃为极限高温，短期内会引起死亡。王志安等[41]在浙江安吉的毛竹林下仿野生种植蛇足石杉，光照强度控制在1 330～3 000 lx[42]，相对湿度控制在80%以上，经过2年的自然栽培，蛇足石杉生长情况良好，能够正常萌芽，并能在新芽的叶腋内产生孢子囊，在开裂后释放孢子。

6 小结与展望

目前以石杉碱甲为原料的哈伯因、双益平等药品已获得国家食品药品监督管理局的批准，并已上市。需求的猛增，高利益的诱惑直接导致蛇足石杉野生资源被无节制地采挖，使野生蛇足石杉濒临灭绝。

人工合成石杉碱甲不仅有利于缓解市场需求，还能有效的保护野生蛇足石杉资源。虽然人工合成石杉碱甲技术已有一定的进展，但目前人工合成的石杉碱甲的乙酰胆碱酯酶抑制活性不强，无法与天然提取的石杉碱甲相比。因此，优化石杉碱甲的提取工艺，提高石杉碱甲的提取率，以及选育高含量的蛇足石杉品种，可作为今后的努力方向。通过提取内生菌的次级代谢产物，可作为天然活性产物—石杉碱甲的又一来源，但目前产生的石杉碱甲较少。今后可通过优化培养条件、加入刺激物、筛选高产突变菌株和基因工程等手段来提高石杉碱甲产量。

蛇足石杉为低等蕨类植物，自然条件下蛇足石杉生长缓慢，繁殖能力弱，根据蛇足石杉的资源分布情况，天然的常绿阔叶林和季风常绿阔叶林及其退化的次生生态系统，以及人工柳杉林或阴坡的人工杉木林、毛竹林都是蛇足石杉最适宜的种植地。研究及了解蛇足石杉天然居群的生态因子及居群特点(如温度、湿度、光照)等因素，结合林下仿野生栽培技术，有利于保护稀缺中药资源，促进中药资源的可持续利用。

近年来，利用组织培养快繁技术，以蛇足石杉的茎尖、孢子、孢子囊等为外植体，均发现蛇足石杉中含有内生真菌。以孢子囊为例，孢子囊中含有大量的内生真菌，通过表面灭菌，并不能达到很好的效果，作者根据现有文献中的方法进行试验，未能得到蛇足石杉的原叶体，可能是由于采收孢子囊的季节不同。作者认为，筛选出一种适合内生真菌和外植体共同生长的培养基可作为今后组培研究的方向；侧芽剥离后，造成侧芽死亡等问题也有待进一步的深入研究。

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2017-10-11

浙江省科技计划项目(2016C32044)

俞春英(1992—)，女，浙江杭州人，技术员，大专，研究方向为农学，E-mail:kekedou_ing@163.com。

沈晓霞(1972—)，女，浙江海宁人，教授级高级工程师，硕士，研究方向为育种，E-mail:xiaoxiashen@sina.com。

文献著录格式：俞春英，沈晓霞，沈宇峰，等. 蛇足石杉的研究进展[J].浙江农业科学，2017，58(12)：2179-2183.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171230

S567

A

0528-9017(2017)12-2179-05

张才德)