武 莹，谢燕红，鞠德才

(1.江苏省泰州市华威特(江苏)生物制药有限公司，江苏泰州 225300； 2.福建省三明市新阳镇畜牧兽医水产站)

专题论述

TLRs及转导基因在奶牛乳房炎防控中的研究进展

武 莹1，谢燕红2，鞠德才1

(1.江苏省泰州市华威特(江苏)生物制药有限公司，江苏泰州 225300； 2.福建省三明市新阳镇畜牧兽医水产站)

奶牛乳房炎防控是目前世界范围内仍未完全解决的顽疾之一。奶牛一旦发生乳房炎感染后一般多采用抗生素治疗，不仅可引起奶牛产奶量下降甚至停奶，且有可能导致牛奶中抗生素残留，危害人体健康。TLRs(Toll-like receptors)则能识别病原体的相关分子模式(PAMP)，在天然免疫防御病原体中起着重要作用。TLR4是TLRs家族成员之一，能识别革兰氏阴性菌细胞壁成分中的脂多糖(LPS)和脂磷壁酸，通过信号转导，诱导促炎症因子等基因的表达，使机体产生抗病性。

奶牛乳房炎在给奶牛生产带来巨大经济损失的同时，还严重威胁着人体健康。据金忠明等(2009)[1]报道，目前世界范围内约有三分之一的奶牛患有不同类型的乳房炎。奶牛乳房炎的主要致病因素是病原微生物感染，其中以金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌最为常见[2]。奶牛乳房炎是严重危害奶牛业生产发展的常见疫病之一，是奶业生产者和科研工作者所关注的热点问题之一。

1 奶牛乳房炎的致病机理研究进展

奶牛乳腺组织因其解剖学上的特殊性而容易受到病原微生物的入侵而发生炎症，炎症的发生主要经微生物入侵、乳腺组织内建立感染、引起乳腺炎症乃至全身出现临床症状的一系列过程。

病原菌黏附到乳腺上皮细胞是感染过程的早期事件，黏附过程主要受细菌表面结构和乳汁与乳腺中的宿主因子调节。乳房炎病原菌利用宿主因子，如细胞外基质蛋白、蛋白聚糖和乳蛋白增加其黏附于奶牛乳腺上皮细胞的能力，通过与乳汁中可溶性宿主因子结合进而结合到乳腺上皮细胞。这种“分子桥梁”被病原菌用来活化宿主细胞，即乳腺上皮细胞表面某些特异受体并诱导一系列级联反应，从而使病原菌进入宿主细胞而引发疫病[3-4]。

2000年，Hebert等(2000)[5]首次在慢性感染乳房炎的奶牛乳汁巨噬细胞和腺泡细胞中发现存活的金黄色葡萄球菌，证实金黄色葡萄球菌能侵入腺泡细胞和巨噬细胞。研究发现金黄色葡萄球菌能成功侵入和定居于乳腺上皮细胞并引起宿主细胞的凋亡，是乳汁中白细胞并不能提供有效防卫及金黄色葡萄球菌引起的乳房炎很难防控的重要原因之一。

2 TLRs研究进展

TLR家族成员的结构以细胞外的亮氨酸重复序列(LRR)和细胞内的TIR结构域(TIR)为主要特征，前者主要行使识别配体，以及与其他复合受体结合形成受体复合物，再识别相应的配体；而后者与IL-R1胞质区的结构域同源，故称之为Toll-IL-1受体结构域或TIR结构域，具有嗜同性相互作用，藉此来募集下游含有TIR的信号分子，组成信号复合体[6-7]。

TLRs的组织细胞分布十分广泛，在DC、单核细胞、巨噬细胞和B细胞、上皮细胞、肥大细胞以及成纤维细胞中均有存在，而且每种细胞所表达的TLR种类有所不同，不同的TLR在不同的组织和细胞中表达量也有所不同。TLR1主要在单核细胞、中性粒细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)上表达；TLR2则在单核细胞、中性粒细胞以及树突状细胞中大量表达；TLR3只表达在树突状细胞上；TLR4则主要表达在内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及树突状细胞上；TLR5主要表达于巨噬细胞、树突状细胞上。除TLR3以外的其余TLRs在单核细胞和巨噬细胞中均有表达。此外，TLRs在内皮细胞，脂肪细胞，心肌细胞，肠上皮细胞等其他细胞中也有存在[8-10]。

2.1 TLRs的信号转导通路 哺乳动物TLRs信号转导与果蝇相比，果蝇的Toll-和IMD-途径分别在抗真菌和抗革兰氏阴性菌上是必不可少的，而哺乳动物抗微生物主要依赖的是TLRs的TIR结构域的信号通路。TLRs家族信号通路与IL-1R家族的信号通路则非常相似，都与连接蛋白MyD88相互作用，MyD88在C-端有一个TIR结构域，可以与TLR的TIR结构域相结合，而在N-端有一个TLR能识别的跨膜死亡结构域。通过死亡结构域可与下游的信号分子相结合，即在刺激过程中，MyD88就会吸附很多的死亡结构域——包括丝氨酸/苏氨酸激酶，即IL-1R相关激酶(IRAKs)。IRAKs被磷酸化后，可激活TRAF6，从而截获两个不同的信号通路——JNK和NF-ΚB，活化NF-ΚB和AP21转录因子，诱导炎症性细胞因子、黏附分子等多种基因表达，进而引起炎症反应[11-12]。

一旦奶牛发生乳房炎感染后，大量繁殖的细菌及其代谢产物刺激乳腺组织，导致炎症因子(如TLR4、TNF-A、IL-1等)表达量增加，激活NF-JB信号通路，使NF-JB表达增加，这一通路又能诱导炎性细胞因子和趋化因子的表达，启动TNF-A、IL-1、细胞黏附分子和环氧合酶-2等基因转录，导致TNF-A、IL-1等促炎性因子大量产生，引发炎症反应。并发乳房炎时，乳腺组织中NF-JB基因表达。Boulanger等(2003)[13]采用电泳迁移率变动分析法检测牛奶中蛋白提取物NF-JB复合物活性，结果发现健康奶牛中未检测到NF-JB复合物活性；临床型乳房炎患牛中，则可检测出高水平的NF-JB复合物活性；感染隐性乳房炎奶牛的乳汁细胞中NF-JB活性强度和IL-8及GM-CSF表达水平显著相关，与SCC和中性白细胞所占比率则无相关性。与健康奶牛的乳汁细胞相比，感染乳房炎奶牛的乳汁细胞中IL-8和GM-CSF表达水平则有明显增加。Boutet等(2007)[14]研究发现，催乳素(PRL)能通过NF-JB激活促进牛乳房上皮细胞的炎症反应，经剂量依赖性分析，PRL能显著提高IL-1B、IL-6、IL-8、GMCSF、TNF-A的表达量，则可间接证明发生乳房炎时，NF-JB在乳腺组织中发挥着重要作用。

2.2 TLRs的信号转导分子 据O′Neill LA等(2002)[15]研究，IL-1R和TLRs的信号通路下游信号分子基本相同，包括连接蛋白MyD88，IL-1R相关蛋白酶(IRAKs)，转化生长因子(TGF)，β活化激酶(TAK1)，TAK1结合蛋白1(TAB1)，TAK1结合蛋白2(TAB2)，肿瘤坏死因子相关因子6(TRAF6)，TLR4 能够激活 MyD88 依赖的信号途径，也能被 IL-1、IL-18 和其它 TLR 家族成员的配体激活，TLR4 还能激活 MyD88非依赖的信号途径。

3 展望与应用

据研究报道，目前已有10个TLRs成员被发现，分别为TLR1-10，且已被全部定位。TLR1，TLR6和TLR10定位在6号染色体上，TLR7和TLR8定位在10号染色体上，TLR3和TLR5分别定位在27号和10号染色体上，TLR2和TLR4分别定位在17号染色体的近端和8号染色体的远端，TLR9则定位在22号染色体上[16]。

2006年，Opsal等(2006)[17]克隆了TLR1、TLR6和TLR10基因长度，TLR1全长2743 bp，包含5个外显子；TLR6全长2572 bp，包含3个外显子；TLR10全长2497 bp，只有1个外显子。TLR1，TLR6，TLR10这3个基因在染色体上的顺序为：5′-TLR6-TLR1-TLR10-3′。

2006年，Menzies等(2006)[18]研究了牛、羊TLR1-10和人TLR1-10的同源性。结果发现牛、羊TLR1-10的同源性达95%以上，和人TLR1-10同源性达89%～90%。在牛TLRs的表达谱分析中发现，除TLR6外，其余的TLRs均在皮肤中表达，其中TLR2和TLR7的表达量最高，TLR4的表达量较低。

乳房炎是奶牛生产中的一种常见病，不同品种其发病率不同，因为在很大程度上与个体的遗传因素有关。因此，在奶牛的遗传育种工作中，选取对疾病抗性较好的牛只通过TLR4基因测序，则有可能得到具有优良抗性的编码关键。

近年来，虽然对奶牛的乳房炎抗性相关基因研究方面已经取得了一定进展，但仍有其它具有较大效应的新基因有待研究发现，TLRs的研究成果就是其中一例。

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2016-11-26

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1005-7307(2017)02-0013-003