袁越 袁鑫 新燕 庞立丽

010000 呼和浩特，内蒙古医科大学基础医学院免疫学专业(袁越、新燕)；400044 重庆大学生物工程学院生物工程专业(袁鑫)；102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 卫生部医学病毒和病毒病重点实验室(庞立丽)

人诺如病毒非结构蛋白的结构和功能

袁越 袁鑫 新燕 庞立丽

010000 呼和浩特，内蒙古医科大学基础医学院免疫学专业(袁越、新燕)；400044 重庆大学生物工程学院生物工程专业(袁鑫)；102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 卫生部医学病毒和病毒病重点实验室(庞立丽)

人诺如病毒(Norovirus，NoV)是单股正链的RNA病毒，它是引起全球急性胃肠炎流行和暴发的主要病原体之一，目前已经受到越来越多的关注。由于缺乏合适和成熟的动物模型和体外细胞培养模型，人们对人诺如病毒的流行病学及其基因变异特征的研究较多，但对于病毒的生物学特性、病毒编码蛋白的功能特征及病毒感染和致病机制知之甚少。本文简要总结了诺如病毒非结构蛋白的研究进展，并期望随着最近人诺如病毒体外细胞培养模型的突破，为进一步开展人诺如病毒非结构蛋白的功能研究提供借鉴。

人诺如病毒(Norovirus，NoV)，其最早的原型病毒被称为诺瓦克病毒(Norwalk Viruses)，它是在美国诺瓦克镇急性胃肠炎暴发疫情中患者的粪便标本中被首次发现的。自从1972年被发现以来， NoV已经被确认为是引起全球急性胃肠炎的主要病因[1]。由于缺乏合适的动物模型和体外细胞培养系统，人们对人诺如病毒的复制机制和致病机制的认识进展缓慢。近些年，通过感染性克隆和重组表达系统的研究，对诺如病毒基因编码的蛋白质功能的认识有了一些进展。诺如病毒非结构蛋白在病毒基因组的复制、翻译以及拮抗宿主免疫反应的过程中起到重要的作用，但是关于非结构蛋白在病毒复制和致病过程中的具体作用尚不清楚，有待于我们更深入地研究病毒蛋白的功能以及与细胞蛋白质之间的相互作用[2]。开展诺如病毒非结构蛋白的研究有助于进一步了解诺如病毒的致病机制。这篇综述简要阐明了NoV非结构蛋白的功能的最新研究进展，以便更全面地了解NoV的生物学特征和致病机制。

1 NoV的基因结构

NoV属于杯状病毒科，诺如病毒属，是无包膜的二十面体对称结构的病毒，直径为28～30 nm，表面粗糙，呈球形。NoV的基因组是单股正链RNA，全长约7.3～7.7 kb, GC含量为48%，NoV基因组3′端是多聚腺苷酸，5′端共价连接到病毒编码蛋白VPg。NoV基因组包括三个开放阅读框(Open reading frames, ORFs)，分别为ORF1、ORF2和ORF3。ORF1编码相对分子质量约200×103的蛋白，经蛋白酶水解后产生6个非结构蛋白，分别为P48、NTP酶、P22、3C样蛋白酶、VPg和依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)，它们均在病毒的复制中起着十分重要的作用。ORF2编码一个相对分子质量为56×103的衣壳蛋白VP1; ORF3编码相对分子质量约22×103的次要结构蛋白VP2。根据诺如病毒的RdRp区和衣壳蛋白区的核苷酸序列，现将其分为七个基因组，GI、GII、 GIII、GIV、 GV、GVI和GVII[3]。其中GI细分为9种基因型，GII由22种基因型组成[3-4]。基因组G I、GII和GⅣ可感染人，基因组GIII、GV和GVI以及GVII分别感染牛、鼠和狗。GI和GII是引起人类急性胃肠炎的两个最主要诺如病毒基因组。

2 非结构蛋白

2.1P48P48又称为N端蛋白，即NS1-2,相对分子质量大小在37～48×103之间，由398个氨基酸组成[5]。NS1-2在N末端含有高度无序的脯氨酸，在C末端有跨膜结构域，是半胱天冬酶的切割位点[6]。GI组和GII组NoV P48的长度和序列上各不相同，在此蛋白的C末端，氨基酸具有保守性。GII组camberwell毒株P48蛋白裂解产生两个相对分子质量大小为15×103和22×103的蛋白质。在用无细胞翻译系统对GI型毒株和GII型MD-145毒株的研究中，并没有观察到P48的进一步水解，但并不排除它会在一些未检测到的低水平上进行水解[7-8]。

参与细胞增殖调控的细胞蛋白H-rev107和TIG3具有Hbox/NC基序，Hughes和Stanway指出NoV P48中也有Hbox/NC基序。这些基序如果发挥作用，那么P48的功能就会得到进一步的研究。通过序列分析，预测到在P48的C端360-379氨基酸附近存在一个疏水区。 C-末端的穿膜区(Transmembran, TM)对P48定位不是必须的，但是对P48在细胞中的转运有重要作用。P48与囊泡相关膜蛋白相关蛋白(Vesicle-associated membrane protein-Associated ProteinA,VAP-A)相互作用，而VAP-A在SNARE(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)介导调节囊泡融合中扮演着重要作用。由于RNA病毒复制发生在细胞内的膜上，P48可能是通过VAP-A锚定膜相关复制复合物。通过共聚焦显微镜分析显示在转染细胞中表达的诺如病毒的N端蛋白与高尔基体共定位，从而导致高尔基复合体拆卸变成离散的聚集体。诺如病毒N末端蛋白在细胞中的表达与高尔基体的拆卸有关。Fernandez-Vega等[9]报导过度表达P48蛋白会促进高尔基复合体的拆卸，并阻碍细胞表面蛋白质的表达和运输，以促进细胞膜向其复制复合物的募集。P48 N端蛋白的功能到目前为止是未知的，可能在膜重排和细胞内蛋白质的转运中发挥作用。

2.2P41核苷酸水解酶P41即NS3，与小RNA病毒基因组2C结构类似。猫杯状病毒(Feline Calicivirus, FCV)P41序列中有一个NTP结合基序GPPGIGKT[10]。P41蛋白具有A、B和C三个基序。纯化的P41可以体外结合ATP，A基序中的第168个氨基酸的突变会导致其ATP结合活性消失[11]。P41可以水解ATP，但无法解开合成的RNA：DNA异源双链。除去可以水解ATP，诺如病毒P41可以水解所有NTPs。这些数据表明，P41具有核苷水解酶活性，但不具有解旋酶活性。另外，1 mmol/L 盐酸胍可以抑制肠道病毒的2C ATP酶活性，但是不能抑制NoV P41的NTP酶活性。这种浓度的盐酸胍能在细胞培养中有效地抑制脊髓灰质炎病毒复制，近期成功用人类肠道组织培养人诺如病毒，可以成为研究NoV具有盐酸胍抗性分子机制的平台，推进对NoV复制机制的研究。

NS3蛋白与细胞骨架标志物β微管蛋白共定位，并且诱导形成定位于细胞膜的离散水泡结构。通过荧光显微镜可以观察到这些结构是高度动态的并依赖微管转运。NoV NS3更多地定位于高尔基体和内质网，鼠诺如病毒(murine norovirus, MNV)NS3更多地定位于富含鞘脂类和胆固醇类的区域。MNV和NoV NS3蛋白质以不同的方式与细胞内脂质缔合，这可能在病毒复制和复制复合物建立期间影响其在宿主细胞内的潜在功能。人类NoV NS3和MNV NS3这两种蛋白质在氨基酸水平上存在高度的保守性，这意味着在NoV和MNV的复制周期期间具有潜在的保守功能[12]。

2.3P22P22在NoV基因组的位置类似于在小核糖核酸病毒基因组中3 A蛋白的位置[13]。脊髓灰质炎病毒的3 A蛋白对复制复合物的膜定位非常重要，靶向突变的3 A产生的病毒，其RNA合成能力有缺陷，抑制细胞分泌途径的能力降低。与3 A的复制相关属性一致，从FCV感染的细胞中分离出的具有聚合酶功能的膜复合物中存在p30，而FCV p30与NoV P22相似[14]。

从内质网(Endoplasmic reticulum，ER)到高尔基体蛋白质的运输是由在COPII蛋白复合物中囊泡介导的，而相反的途径从高尔基体到ER蛋白质的运输则是由COPI包被的囊泡介导的，人诺如病毒P22的表达导致分泌途径中各种成分的重排和改变。由于氨基酸112-127之间的两亲α-螺旋，残基103-148负责P22的膜结合。诺如病毒的非结构蛋白P22编码一种独特的而且保守的基序，其基序模仿传统的二酸性ER基序的信号输出。由于NoV、MNV和FCV均诱导高尔基体解离，比较杯状病毒中的同源物P22如下特征：序列相似性、保守基序、 细胞分布和位置、诱导高尔基体解离的能力和抑制细胞蛋白分泌。在氨基酸50-148之内具有两个明显的保守性序列，其一是膜结合结构域(Membrane association domain，MAD)基序,具有良好的保守性序列并在所有的基因型中有着相似的作用。其二是YXΦESDG基序,模拟ERES(ER exit sites)抑制COPII小泡运输蛋白，其中的Y和E残基在导致高尔基体解离，拮抗依赖高尔基体的细胞蛋白分泌，抑制细胞分泌通路中扮演着重要的角色。两亲性α-螺旋是存在于人类NoV和MNV P22同源物中相应的氨基酸112-127之间MAD。通过对所有NoV P22 L比较，结果发现P22都会抑制细胞蛋白分泌，并在细胞定位上具有不同程度的差异。

2.4VPgVPg即NS5，在小RNA病毒中，VPg的长度是22个氨基酸。在诺如病毒中，VPg长度是133个氨基酸，相对分子质量大约为15×103共价连接到mRNA的基因组和亚基因组的5′末端[15]。NS5的表达诱导G0 / G1期停滞。 VPg在体外表达体系和培养的感染细胞中能够与翻译起始因子结合，因而它被认为能够启动转录推测这种病毒蛋白质在病毒基因组的复制中起着重要的作用，类似于小RNA病毒中VPg的作用，并能促进RNA合成。VPg对于诺如病毒基因组和亚基因组RNA的翻译起始是必需的，并且似乎也起到核糖体的募集作用。在RNA合成中，诺如病毒VPg含有酪氨酸，类似于人诺如病毒的Tyr27，其羟基侧链涉及RNA合成。VPg蛋白质与eIFs相互作用并起到替代一种帽状蛋白质的作用[16]。

MNV通过VPg26位酪氨酸共价连接鸟苷二磷酸(guanosine diphosphate, GDP)。VPg与支架蛋白 eIF4G直接作用[16-17]。MNV VPg蛋白C端20aa介导了与eIF4G 4GM片段中的HEAT-1区特异直接的结合。据报道，缺乏VPg的杯状病毒基因组RNA不具有传染性，但它有保护人NoV基因组免受宿主免疫系统识别的作用[18]。FCV 的VPg和VP1相互作用，可能有助于选择性包装VPg偶联的病毒RNA。实验表明VPg在病毒RNA翻译中起作用，除去FCV 基因组RNA中的VPg会降低病毒蛋白体外合成的水平。推测VPg可以作用于病毒RNA对核糖体的募集包装新合成的病毒基因组[19]。

2.53C样蛋白酶NoV编码一个单一的蛋白酶，由于它与小核糖核酸3C类似，因此又被称为3C样蛋白酶(3C-like protease，3CLpro)，属于糜蛋白酶样蛋白酶家族的一员，它的相对分子质量大小约为19×103。3CLpro与细胞内的胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(chymotrypsin-like serine proteases)的结构相似，与小RNA病毒的3CLpro具有相同的氨基酸序列基序，主要在QG、EG和EA这三个裂解位点把诺如病毒的开放阅读框1(Open reading frame 1，ORF1)多聚蛋白加工成非结构蛋白[20]。

3CLpro的活性位点由氨基酸His30、Glu54, 和 Cys139这三个催化三联体组成[21- 22]。此外，除了在切割病毒蛋白质中发挥作用，也通过裂解细胞多聚腺苷酸A结合蛋白来抑制细胞翻译[23]。在GDSG基序中的Ser195残基是蛋白质水解过程中必不可少的一个亲和基的活性部位。Cys139可以取代Ser残基，对于活性无明显影响，证实3CLpro是丝氨酸蛋白酶家族的一个成员。小RNA病毒的3CLpro相应区域如β-ribbon，可灵活参与底物结合[24- 25]。

2.6依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp) NoV RdRp位于ORF1 C端，分子量大小约为57 kDa。随着RHDV和FCV RdRp的活性报导，确认了重组杆状病毒表达NVRdRp的体外酶活性。Ng等人揭示了GII型NV Ast6139/01/Sp株 RdRp的晶体结构，并显示与兔出血症病毒的RdRp结构普遍相似[26]。NoV RdRp具有其它正链RNA病毒RdRp的结构特性，具有聚合酶共有的结构域如手指(Fingers)，手掌(Palm)和拇指(Thumb)。NoV RdRp C末端定位于起催化作用的天冬氨酸残基附近的活性位点裂缝中。揭示这一小区域的位置可能类似于QB噬菌体RdRp的“plough”环，在启动RNA引物合成中起稳定引物的作用。

NoV RdRp和许多病毒RdRps的活性位点发现都具有保守的氨基酸基序，甘氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(glycine-aspartic acid-aspartic acid，GDD)。与其他正链RNA病毒一样，NoV基因组RNA可作为负链RNA合成的模板。负链RNA反过来又作为合成子代基因组正链RNA分子的模板。因此RdRp对于正负链RNA分子的合成起到十分重要的作用。诺如病毒的RdRp在没有引物的情况下，也能够在诺如病毒基因组3′端合成cRNA。3CLpro-RdRp的前体是一个具有两种功能的蛋白,即蛋白酶和聚合酶活性,体外实验报导，单独聚合酶跟前体有类似的活性[27]。诺如病毒的RdRp是在诺如病毒的复制中起着关键作用的一种酶。通过抑制HCV RdRp并有助于治愈HCV感染，所以病毒RdRps是研发抗病毒药物的关键。因此，诺如病毒RdRp的结构和功能研究不仅仅有助于了解诺如病毒复制，而且也有助于抗病毒药物的选择和发展。

3 结论和展望

通过以上的总结，我们不难发现目前关于人NoV非结构蛋白的研究更多是源于其他杯状病毒或者小RNA病毒非结构蛋白的研究或体外非感染性的人诺如病毒单一基因表达的研究。因此，真实、完整的人诺如病毒非结构蛋白研究有待更多更好的模型及深入研究。近期人诺如病毒体外细胞培养模型的成功为研究人诺如病毒非结构蛋白提供了平台，将带动对诺如病毒非结构蛋白未知功能的探索，以更深入地了解人诺如病毒的致病机制。

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2017-06-20)

(本文编辑：唐浏英)

Structureandfunctionofhumannorovirusnonstructuralproteins

YuanYue,YuanXin,XinYan,PangLili

DepartmentofImmunology,BasicSchoolofMedicalScience,InnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010110,China(YuanY,XinY);DepartmentofBioengineering,SchoolofBiologicalEngineering,ChongqingUniversity,Chongqing,China(YuanX);KeyLabortoryofMedicalVirology,MinistryofHealth，NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China(PangLL)YuanYueandYuanXinarethefirstauthorswhocontributedequallytothisarticle

XinYan,Email:xinyan_2505@126.com;PangLili,Email:cactusea@163.com

Norovirus (NoV), a single stranded RNA virus, is the major causative agent of the global acute gastroenteritis in humans, and it has drawn more and more attention. Because of the lack of appropriate animal models and in vitro cell culture models, people have studied and understood more about the epidemiology and genetic variation of human viruses. The functional characteristics of the viral encoded protein and the pathogenesis of virus infection are poorly understood. In this paper, we summarize the progress in studies on characteristics of non-structural protein of norovirus, and hope that with the recent breakthrough in human cell culture model of human norovirus, it can be used as a tool for further research on the function of human norovirus non-structural protein.

Human norovirus; Calicivirus; Nonstructural protein; Viral replication

袁越与袁鑫对本文有同等贡献

新燕，Email：xinyan_2505@126.com；庞立丽，Email：cactusea@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.022

诺如病毒,人；杯状病毒；非结构蛋白；病毒复制

国家自然科学基金(81601813)

FundprogramsNational Natural Science Foundation of China(81601813)