刘 琳赵小东温 臻任丽臻王艺嵘成玥美综述 张学红审校

1.兰州大学第一医院生殖医学专科医院（兰州 730000）；2.甘肃省生殖医学与胚胎重点实验室；3.兰州大学

Y染色体微缺失对ICSI结局的影响研究进展

刘 琳1,2赵小东1,2温 臻3任丽臻3王艺嵘3成玥美3综述 张学红1,2审校

1.兰州大学第一医院生殖医学专科医院（兰州 730000）；2.甘肃省生殖医学与胚胎重点实验室；3.兰州大学

全世界不育夫妇约占已婚育龄夫妇的10%～15%，其中因男性因素导致的约占50%，少精子、弱精子症是造成男性不育或生育力下降的主要原因之一。细胞遗传学和分子生物学等领域的快速发展使得无精子因子（azoospermia factor, AZF）[1]被科学家们广泛认知并接受。AZF位于 Y染色体长臂（Yq），这一区域的异常与大多数原发性无精子症密切相关[2]，其发生率在男性不育的遗传因素中居第二位，仅次于Klinefelter's syndrome [克氏综合征，(47, XXY)]。约有10%～20%男性原发无精子与少精子症患者中存在AZF微缺失。

卵胞浆内单精子显微注射技术（Intracytoplasmic sperm injection, ICSI）的出现，改写了以前人们普遍认为的无精子症患者和严重少精子症患者无法生育的观念，但此项新技术的出现，也不可避免的将携带染色体异常、基因缺失或突变的精子注入到卵胞浆内，使得各种遗传缺陷传递给下一代的风险大大增加。由于 ICSI 操作逃避了一些自然选择屏障，Y染色体微缺失或染色体异常患者的后代将面临遗传缺陷垂直传递的风险。因此，深入研究Y染色体微缺失在ICSI过程中的重要作用对辅助生殖技术的发展具有重要意义。本文对现有的关于Y染色体微缺失对ICSI成功率影响的各种研究作一综述。

一、AZF的构成

1996年Vogt等[1]将AZF基因划分为 3个无重叠部分，分别命名Yq11的近段、中段和远段为AZFa、AZFb和AZFc。有大量的回文序列存在于Y 染色体上，其内部的非等位基因同源重组是Y染色体微缺失的主要原因。1999年，Kent- First 等研究者发现在AZFb和AZFc之间存在一个AZFd区[3]，缺失率大约为5%，占AZF总缺失的19.6%。一般认为，该区的缺失存在于中等程度的少精子或数目正常但形态异常精子的患者中，但该区域内的候选成分至今尚未找到，该区是否存在仍有争议。

二、Y染色体微缺失的发生类型

目前已经发现的Y染色体微缺失类型主要包括：AZFa区缺失、AZFa区部分缺失，AZFb区缺失、AZFb区部分缺失，AZFc区缺失、AZFc区部分缺失以及其他区域的联合缺失如AZFb+c区缺失和AZFa+b+c区缺失等[4]。AZFb区及AZFc区由扩增子家族blue (b)、turquoise (t)、green (g)、red (r)、yellow (y)、gray(g)组成，多为顺向重复和反向重复序列，减数分裂过程中扩增子发生同源重组是AZFb区、AZFc区及AZFb+c区域联合缺失发生的分子基础[5]。

现有的研究表明，Y染色体微缺失发生的原因主要有以下3种：（1）de novo 缺失：是指患者缺失而患者男性直系亲属外周血分析中未见缺失。这种缺失类型可能发生在父代精子生成的过程中或在子代早期胚胎发育过程中产生[1,6,7]；（2）垂直遗传：是指父代睾丸生殖细胞系存在缺失并产生有缺失的精子，缺失精子与卵子结合产生继承了其父亲生殖细胞中有缺失的Y染色体微缺失的子代个体[8,9]；（3）在睾丸生殖细胞系中存在缺失的嵌合体，如父亲外周血淋巴细胞中未见缺失，而通过ICSI的男性后代却有Y染色体微缺失，则说明嵌合体的存在[10]。

三、Y染色体微缺失的检测

对无精子症或者严重少精子症患者来说，Y染色体微缺失是常规检测项目。 2004年欧洲男科学会（EAA）和欧洲分子遗传实验质控网（EMQN）提出了Y染色体微缺失检测标准，即采用聚合酶链反应进行检测分析，90%以上的微缺失可以被检出。最新版指南推荐采用两管多重PCR方法，检测位点如下：AZFa： sY84，sY86；AZFb：sY127，sY134；AZFc：sY254，sY255对照：SRY，ZFX，ZFY[11]。

一般人群中Y染色体微缺失发生的概率约为1/4 000，在无精子或少精子的不育男性中比例则显著增加。依据不同实验室及不同研究人群，Y染色体发生的概率大约为1%～58%。一般而言，在非梗阻性无精子症患者中缺失的概率大约为15%～20%，在少精子症患者中微缺失发生的概率大约为7%～10%，需要做ICSI的患者中缺失比例大约占到2%～3%[12,13]。

国内外研究显示，不同种族、地区的严重少精子症或无精子症的不育男性，其Y染色体微缺失的发生概率不同，为0.7%～34.5%间不等，具有明显的地区与种族差异[14]。

四、Y染色体不同类型缺失的重要临床意义

为了寻找不育的原因、获得自身和后代遗传学咨询、选择助孕方式，无精子症和严重少精子症的不育患者需要在接受助孕治疗前进行Y染色体微缺失的检测。Y 染色体微缺失发生的区域不同，相应的临床表型也有所不同，检测出的微缺失类型对睾丸活检能否发现成熟精子预测的意义不同。由于Y 染色体在精子发生时, 无法同其他常染色体一样，进行DNA修复，因此只要有一个基因出现微缺陷就会发生效应。

1. AZFa区完全缺失大多表现为唯支持细胞综合征，大约占到5%。完全缺失的患者，其精子阻滞在青春期前阶段，无生育能力并伴有睾丸体积缩小，为绝对的无精子症，无法通过ICSI获得后代[15-19]。

2. AZFb区缺失和AZFb+c区缺失大约占总缺失的35%左右，完全缺失的患者表现为生精阻滞，主要停留在精母细胞或精子细胞阶段；部分缺失的患者临床表现多样化，包括唯支持细胞综合征、无精子症或少精子症，不推荐给这类病人施行ICSI[20,21]。

以上3种类型的微缺失提示非阻塞性无精子症，睾丸取精术（testicular sperm extraction, TESE）/经皮附睾抽吸取精术（percutaneous epididymal sperm aspiration, PESA）常取精失败，故应避免患者进行穿刺取精的痛苦。

3. AZFc区缺失大约占到35%，该区域的缺失会造成超过60%AZF区域发生缺失。该类患者的临床和睾丸组织学表型具有多样性：可以表现为性激素水平和睾丸体积的正常或异常；可以有正常的生育能力，从而导致AZFc缺失的垂直遗传；也可以为无精子症和少弱精子症，导致不育[22]。赵连明等的研究表明，虽然大约有50% 的单独 AZFc 缺失患者能射出精子，但大部分人表现为重度或者严重少精子症，长期药物治疗效果不明显，应及早对这类患者经皮附睾精子抽吸术/睾丸附睾取精（TESE/PESA）技术获得精子，而后采用ICSI可成功受孕[23]。

4. AZFd 区缺失主要表现为精子数目正常，但精子形态异常或者是轻度的少精子症。

5. AZFa+b+c 3个区域全部缺失的患者，一般表现为染色体核型异常。临床100%表现为无精子症，无法从睾丸中获得精子。因此，可以不必对这类患者进行睾丸穿刺增加其痛苦，同时女方应避免进行促排卵治疗，使患者无谓增加经济负担，并造成女方因促排卵可能面临的并发症[24]。

值得注意的是，AZFc区缺失患者可能出现随时间进行性精子数量减少的现象，最终可发展至无精子症[25-27]。为避免发展到有创伤的取精或者不能生育，这些患者应及早治疗或提前进行精液冷冻保存，并通过胚胎植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis, PGD）的方法选择女性胚胎, 从而避免Y染色体微缺失的传递。另外，AZFc区缺失患者的男性子代将是AZFc区缺失的携带者。因此，AZFc区域缺失患者的男性后代在成年早期也应考虑精液冷冻保存。

另外，部分患者有内分泌异常的表现，临床上可表现为原发睾丸衰竭，导致激素水平的改变，睾酮产生减少、FSH增高、LH正常或相应不同程度的增高表现[28]。

五、Y染色体微缺失对ICSI结局的影响

Y染色体微缺失的个体因其精子发生过程存在缺陷，所以这种缺失在自然受孕的情况下很少代代相传。ICSI技术的出现使无精子和少精子症患者获得生育机会，但也可能会向卵胞浆内注入未经自然选择的携带染色体异常或Y 染色体微缺失的精子，从而将这些遗传缺陷垂直传递给下一代，影响人类的优生和自然进化。

1. Y染色体微缺失自然传递给男性后代 Y染色体微缺失的主要表型是男性不育，因此，通过自然传播的AZF缺失的报道比较少见。Kühnert等报道了一例特殊病例：AZFc区缺失由父亲垂直遗传给儿子[29]。Zhu等发现在19例汉族不育男性中，AZFc区的缺失可以垂直遗传两代到三代[30]。Samli等发现一例父亲将AZFb区缺失垂直自然遗传给3个儿子的特殊病例[31]。Dai等的研究表明，父亲具有Y染色体微缺失，则其传递给儿子的概率约为70%[6]。这也说明，尽管AZFc缺失严重影响精子发生的过程，但并不能完全阻滞自发怀孕。

2. Y染色体微缺失通过ICSI 传递给男性后代 男性不育患者因ICSI技术的大力发展，使得助孕技术翻开了新的篇章，然而越过自然选择机制的行为使得子代遗传缺陷风险显著增加。与自然传递给子代相比，Y染色体的微缺失因ICSI传递给子代则有相对较多的报道。

1996年，Kent-First等[32]首次得到32对因男方因素不育的夫妇通过ICSI 获得子代的研究。对父亲具有Y染色体微缺失的3对父子进行研究，其中2对父子具有AZFb和AZFc之间区域的缺失，第三对父子具有AZFb和AZFc区域大片段的缺失。通过ICSI产生的子代Y染色体微缺失的概率为9.4%，这个概率和普通男性不育中微缺失的概率相近。Liu等[33]研究了199个汉族父亲和来自辅助生殖技术的228个子代之间的Y染色体微缺失的情况，其中行IVF出生的子代85个、ICSI出生的子代73个，自然怀孕70个。研究结果表明，Y染色体微缺失的概率在IVF，ICSI，以及自然怀孕案例中的比例分别为10.7%，3.2%和8.2%，无显著性差异。在70例自然生产的子代中新发1例子代Y染色体微缺失，在158例经辅助生殖产生的子代中未发生Y染色体微缺失。研究结果表明，辅助生殖技术并不能显著提高子代Y染色体微缺失的概率。Oates等[34]的研究表明，42例AZFc区缺失的父亲通过ICSI生育得到的子代中18例均遗传了其父代的AZFc区缺失，但其缺失长度并未增加。国内学者王丽霞等[35]在488名无精子、少精子症患者中发现56例患者存在Y染色体微缺失，且均为AZFc缺失。比较少精、无精患者缺失组和未缺失组未发现有胎儿畸形、流产率、早产率、后代出生体质量、双胎妊娠率与男婴比例等存在差异。缺失组成功妊娠19例，其中出生男婴8例，行AZF微缺失检测，发现均为AZFc缺失。由此可知，AZFc微缺失可以由父亲遗传给男性子代，缺失片段的长度和类型基本一致，但是成年后同样会有精子发生障碍和不育的风险，这与近年来的文献报道的结果相一致[36-40]。而国内外文献对从父亲垂直遗传而来的除AZFc区之外的缺失类型尚未见报道，同时亦没有证据证明AZF微缺失患者的后代的缺失范围会扩大。

van Golde等[42]比较19例AZFc区缺失患者和同期239例正常精液排出的ICSI妊娠结局，结果发现，AZFc区缺失患者的受精率，胚胎质量远远低于对照组，但是妊娠率和带婴回家率之间并无显著差异。国内孙宝刚等[41]对109例妻子不明原因流产男性患者进行检测，结果表明：在109例反复流产夫妇中Y染色体异常28例。Y染色体结构异常18例，数目异常2例，多态性变异8例，未发现存在Y染色体缺失的病例。吴畏研究组[43]比较了Y 染色体微缺失患者和无缺失的无精子或严重少弱精子症患者的ICSI治疗结局。结果表明，两组在女方年龄、不孕年限、男方年龄、获卵数、ICSI 卵子数、平均移植胚胎数等基本情况差别无统计学意义；Y染色体微缺失组与对照组相比，受精率、卵裂率、优质胚胎率、胚胎种植率、生化妊娠率、临床妊娠率、早期流产率、活产率差别无统计学意义，说明Y染色体微缺失不影响ICSI治疗结局。王丽娟研究组[44]以22例Y染色体微缺失患者进行的27个ICSI治疗周期为研究组，以88例无缺失的严重少精子症或无精子症患者101个ICSI治疗周期为对照组。研究结果表明，研究组和对照组的受精率、卵裂率、优质胚胎率、新鲜周期移植优质胚胎率、临床妊娠率、胚胎着床率、早期流产率、活产率、男婴比例等均无统计学差异。以上研究结果都表明，Y染色体微缺失对ICSI治疗周期的妊娠结局无显著性影响。

3. Y染色体微缺失不同缺失热点对ICSI成功率的影响 研究表明：Y染色体微缺失患者缺失的热点不同，影响ICSI的成功率不同，这一点与缺失热区分布和睾丸组织学类型的关系相一致。吴畏研究组[43]的结果表明，虽然ICSI治疗周期形成的胚胎情况和妊娠结局与Y染色体微缺失并无显著性影响，但不同的缺失位点导致的ICSI结局是不尽相同的，其他类型Y染色体微缺失患者配偶临床妊娠机会低于AZFd区部分缺失加c区全部缺失患者。Zhu等[45]2015的最新研究共招募61例AZFc区缺失的不育患者，根据sY152是否单独缺失为标准将实验组分为两组，以50例无精子或少精子但无缺失的患者为对照组。研究结果发现，sY152组和AZFc组的受精率较对照组低。3组之间在MII卵数、胚胎质量、2PN数、可移植胚胎数、临床妊娠率、种植率、流产率、多胎率、分娩率、男/女性别比率等方面没有显著差异。提示sY152单独缺失导致较低的受精率，但对最终的妊娠结局不产生大的影响。de Llanos等[46]比较了4例gr/gr缺失患者的ICSI结果，研究表明，取卵数、合子数及妊娠率均无显著性差别，与Oates等[34]的研究结果一致。

六、结语

男性不育患者多数因病因不清缺乏特异有效的治疗。因采用不恰当的治疗方法造成的资源、人力的浪费和病人的痛苦令人担忧。结合国内外关于Y染色体微缺失的研究进展，我们建议将Y染色体微缺失的筛查作为对男性不育患者的一项常规检查项目，找到不育的真正原因，从而避免不必要的药物及手术治疗。

尽管已经有大量的针对Y染色体微缺失的研究，然而来自不同地理分布，不同民族的人群得到的结果并不是很一致，甚至出现相反的结果。基于现在已经得到的数据，我们可以得到以下基本信息：（1）Y染色体微缺失在无精子症以及严重的少精子症患者中十分常见；（2）尽管大多数的AZF缺失是新发的，仍有通过自然孕育或ICSI垂直遗传给子代的缺失；（3）为了更好地了解Y染色体微缺失发生的机制，对病人的筛选标准要更加准确，临床资料的登记以及各种检查指标应标准化，应加强对男性不育患者Y染色体微缺失的父代和子代的追踪和随访，以期正确评估Y染色体微缺失通过ICSI技术对子代可能造成的风险，并通过遗传家系研究进一步明确。

ICSI技术的普遍开展和大规模应用引起的下一代男性不育问题会慢慢凸显，辅助生殖科研人员应尽早从分子流行病的角度深入研究Y染色体微缺失的遗传机制，使Y染色体微缺失的检测不仅仅是一种检测手段，同时成为一种合理有效的预测及阻断手段。

致谢：本文由甘肃省卫生行业科研计划项目（项目编号：GSWSKY-2015-50）；兰州大学第一医院院内基金（项目编号：ldyyyn2013-04）；兰州大学国家级大学生创新创业项目（项目编号：201710730170）基金资助

Y染色体/遗传学; 精子注射, 细胞质内;生殖技术, 辅助; 不育, 男性

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（2017-04-05收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.03.015

R 698.2