王华龙， 米铁柱， 甄 毓， 刘 乾， 于志刚

(1.中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003；2.海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛 266100；3.海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室，山东 青岛 266100；4.海洋国家实验室海洋生态与环境科学功能实验室，山东 青岛 266071)

基于玛氏骨条藻转录组的细胞死亡相关功能基因解析*

王华龙1,2,4， 米铁柱2,4**， 甄 毓2,4， 刘 乾1,2,4， 于志刚3,4

(1.中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003；2.海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛 266100；3.海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室，山东 青岛 266100；4.海洋国家实验室海洋生态与环境科学功能实验室，山东 青岛 266071)

本研究以玛氏骨条藻(Skeletonemamarinoi)转录组信息为基础，发现玛氏骨条藻中存在26个与细胞死亡相关的酶以及37个编码这些酶的基因。这些编码基因的序列比对结果表明，其与假微型海链藻(Thalassiosirapseudonana)和大洋海链藻(Thalassiosiraoceanica)的同源基因具有较高的一致性。对这些样品进行数字基因表达谱的差异基因分析，获得了不同生长时期时与细胞死亡过程有关的编码基因的差异表达数据。结果发现，在稳定期和衰亡期，与抗氧化胁迫作用相关的关键酶 (如过氧化物酶5、铜锌超氧化物歧化酶)、与RNA的加工与降解过程有关的功能基因(如多核糖核苷酸核苷转移酶、5’～3’核糖核酸外切酶 2)以及细胞死亡特异蛋白的基因表达量显著高于指数期。本论文主要是通过对转录组数据进行分析得到基因转录组水平差异表达结果，为蛋白水平研究提供一种可能性变化趋势和潜在数据依据，同时为以后研究提供数据基础及研究方向。本研究也为进一步探讨硅藻的细胞死亡机制奠定了基础，也为深入理解赤潮的消亡过程提供了新的视角。

玛氏骨条藻；转录组分析；细胞死亡

浮游植物的死亡是水体浮游植物生物量改变的重要原因[1]。浮游植物的死亡会改变水体浮游植物的多样性以及引起食物链结构的变化，继而引起其他营养级生物组成变化[2]。浮游植物的消亡过程对于全球海洋初级生产力的流通和营养物质的再循环具有重要作用[3]。浮游植物细胞死亡的主要原因包括浮游动物和底栖滤食者的捕食、溶藻细菌和病毒侵染所引起的藻细胞裂解、程序性细胞死亡(Programmed cell death, PCD)[4-5]以及营养盐限制、光抑制等外部因素所引起的细胞死亡。目前，对于浮游植物细胞死亡的实验生态学研究较多[6-8]，但针对细胞死亡的分子机制研究较少。

为更好地理解浮游植物对海洋生态系统的影响，明晰调节浮游植物死亡的分子机制是必不可少的。通过对不同培养条件的浮游植物转录组进行高通量测序，能够对其基因组进行转录水平的分析，从而确定编码代谢途径相关酶的基因。在此基础上解析相关的生物合成途径，并对差异表达的基因和蛋白质进行定量与分析，有助于了解参与生物生长代谢过程的代谢组件及其可能的参与方式以及它们与环境互作的作用机制[9-13]。玛氏骨条藻(Skeletonemamarinoi)是2005年由Sarno等分离确认的，是一种在全球近岸海域广泛分布的广温广盐型海洋微型浮游硅藻[14]，亦是我国沿海主要的硅藻类群[15-16]。本研究中我们测定并分析了玛氏骨条藻不同生长时期的转录组，并在此基础上分析玛氏骨条藻细胞死亡相关基因的差异表达，以期为阐明细胞死亡时的内在分子机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 玛氏骨条藻的培养

玛氏骨条藻分离自青岛近海海域，藻种保存于中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室藻种室，采用常规f/2培养基培养，光暗周期为12 h/12 h，光照强度为100 μmol photons ·m-2·s-1，培养温度为(20±1)℃。实验用海水取自青岛近海，盐度33，pH为7.8～8.0。

1.2 测序样品准备

本实验开始前，作者进行了三次在指数生长末期进行接种培养的预处理，以保证藻细胞生长状态良好和同步。我们基于玛氏骨条藻生长趋势收集实验第6天(指数期，Exponential phase, EP)、第13天(稳定期，Stationary phase, SP)和第20 天(衰亡期，Decline phase, DP)的藻细胞。每个实验组3个平行样，离心收集藻细胞，并迅速于液氮中保存样品。样品由北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行总RNA的提取及Illumina Hiseq2000双端测序。

1.3 数据预处理及de novo拼接

高通量测序平台Illumina HiSeq2000所得到的原始数据经CASAVA碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列(Sequenced Reads)，即Raw Data或Raw Reads。继而对Raw Data进行质量评估，主要包括测序错误率分布检查和A/T/G/C含量分布检查2个部分。随后，对原始数据进行过滤处理，以保证信息分析质量并得到有效序列(Clean Reads)。以Trinity软件(r2012-10-05)[17]将有效序列进行denovo拼接成为转录组，以此作为后续分析的参考序列。

1.4 功能注释及代谢途径分析

将拼接得到的转录组利用NCBI blast 2.2.28+[18]算法分别比对到NCBI的NR、NT、Swiss-Prot和KOG数据库，KOG的E value阈值设为1E-3，另外3个E value阈值设为1E-5，继而预测转录本的功能并进行功能归类。利用HMMER 3.0 package进行Pfam蛋白结构预测。利用软件Blast2GO v2.5[19]和GO功能注释得到基于NR和Pfam的蛋白注释结果。拼接得到的转录组提交至KAAS服务器进行KEGG代谢途径分析[20-21]。最后利用RSEM软件[22]将样品的有效序列与参比序列进行定位分析。RSEM中使用bowtie默认参数。对bowtie的比对结果进行统计，进一步得到每个样品比对到每个基因上的read count数目。对read count数据采用基于负二项分布的DESeq处理后，进行基因差异表达分析[23-25]。本实验中，定义Lf=log2(Fold Change)=log2(实验组read count/对照组read count)。以q-value<0.005和|Lf|>1为筛选条件判断基因是否为差异基因[26]，并利用该值对玛氏骨条藻不同生长时期相关代谢途径中基因的表达水平进行比较。

2 结果与讨论

2.1 转录组测序信息及拼接

对Illumina Hiseq2000双端测序所得原始数据进行过滤以去除低质量数据，共获得58 592 306 bp用于拼接的高质量有效序列，占原始序列的96.15%。将所有的有效序列利用denovo拼接总共获得39 098个转录本，20 319个unigene(每个基因中拼接获得的最长的转录本)，长度范围200～20 000 bp。

2.2 功能注释及分析

拼接得到的所有转录本比对到各数据库(包括相关已测序硅藻序列)结果显示，10 826个转录本能够注释到GO编号，同时5 095个转录本能够与KOG数据中的序列比对上。KEGG代谢途径分析拼接得到的所有转录本，3 816个转录本可以比对分配到EC编号，并注释到225条代谢途径，包括凋亡途径、RNA降解、过氧化物酶体代谢等与细胞死亡相关的途径。

基于转录组的功能注释及分析，玛氏骨条藻中与细胞死亡相关的途径有26个相关酶以及37个编码基因的转录本(见表1)。利用BLASTx进一步比较分析了玛氏骨条藻细胞死亡相关功能基因序列与假微型海链藻(Thalassiosirapseudonana)、大洋海链藻(Thalassiosiraoceanica)和三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)同源基因的一致性，结果显示,玛氏骨条藻与同属中心纲的假微型海链藻和大洋海链藻有着相对更高的基因序列一致性，而与羽纹纲的三角褐指藻的序列一致性相对较低(见表1)。

上表所述基因的主要相关细胞过程和功能涉及氧胁迫、RNA降解与PCD。浮游植物胞内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)升高是细胞死亡的一个重要指标，如Evans C研究发现不论病毒还是非病毒引起的赫氏颗石藻(Emilianiahuxleyi)死亡，ROS上升都是必要条件[27]。CO2胁迫也能导致加顿多甲藻(Peridiniumgatunense)ROS上升，而且在ROS上调之前加入过氧化氢酶，或者加入ROS清除剂，都可显著减少细胞死亡，这些结果表明ROS在加顿多甲藻死亡过程中必不可少[28]。过氧化物酶5(PRDX5，EC: 1.11.1.15)和铜锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn-SOD，EC: 1.15.1.1)均具有较强的抗氧化胁迫作用，能够清除胞内有害的ROS。

在RNA分子合成过程中发生的任何错误，或是不必要的RNA累积对于藻细胞都是有害的。因此清除有缺陷或是不再需要的RNA是藻细胞保持活力的一个关键步骤。在胁迫条件时RNA降解速率的显著提高，也表明藻细胞活力已显著降低，有可能会造成细胞死亡。多核糖核苷酸核苷转移酶(PNPT，EC: 2.7.7.8)、CCR4-NOT转录复合体亚基6(CNOT6，EC: 3.1.13.4)、5’～3’核糖核酸外切酶 2(XRN2)、ATP依赖型RNA解旋酶(DDX6，EC: 3.6.4.13)、U6 核内小RNA相关的类Sm蛋白(LSM8) 均为与RNA降解过程相关的关键酶或蛋白。

续表

注：NM表示该转录本在另三种硅藻中无相似序列；*表示与指数期相比较有显著差异表达的功能基因。

Note:NM indicate the transcript is not have similar sequence in other three ditoms.*indicate the functional gene has significant difference compared to exponential phase.

浮游植物PCD最易接受的解释是能够从种群中移除受损害的细胞，可以让各种资源被健康生长的藻细胞所利用，或者通过部分细胞的死亡为同种群其他细胞提供生存机会[5]。死亡特异蛋白(Death specific protein，DSP)在浮游植物发生PCD过程中具有重要促进作用。在衰老、光限制、光系统II (PSII)受到化学抑制时，中肋骨条藻(Skeletonemacostatum)的DSP均能被诱导高表达[29]。假微型海链藻可以通过Fe限制诱导DSP高表达[30]。

2.3 细胞死亡途径中基因差异表达的分析

比较玛氏骨条藻在不同生长时期与细胞死亡途径相关基因的表达水平，结果发现：稳定期与衰亡期相比较，玛氏骨条藻与细胞死亡途径相关基因的表达水平无显著差异；而与指数期相比较，在稳定期和衰亡期，与细胞死亡途径相关的26个酶编码基因的表达水平(Lf值)有显著差别的共计12个。图1中列出了这些差异表达基因在不同培养时期的Lf值。

通过比较处于指数期、稳定期和衰亡期玛氏骨条藻基因差异表达水平,发现与氧胁迫相关的过氧化物酶5(PRDX5，EC: 1.11.1.15)和铜锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn-SOD，EC: 1.15.1.1)基因显著差异表达。如图1 (a)、(b)所示，参与抗氧化作用、能够降低细胞内ROS水平的过氧化物酶5在衰亡期的Lf值为-4.56，与指数期相比较显著下调。能够对抗与阻断氧自由基对细胞造成损害的铜锌超氧化物歧化酶在稳定期、衰亡期的Lf值分别为-5.03和-2.93，均与指数期存在显著差异。Mohamed研究发现当细胞内活性氧含量显著升高继而进入凋亡过程时, PRDX5基因表达量显著降低[31]。上述结果表明，玛氏骨条藻生长进入稳定期、衰亡期后PRDX5和Cu-Zn-SOD基因转录组水平表达量显著降低，可能会导致胞内活性氧浓度较高而使得细胞已不能够通过释放大量抗氧化酶进行自我修复。

与RNA降解过程相关的多核糖核苷酸核苷转移酶(PNPT，EC: 2.7.7.8)、CCR4-NOT转录复合体亚基6(CNOT6，EC: 3.1.13.4)、5’～3’核糖核酸外切酶 2(XRN2)、ATP依赖型RNA解旋酶(DDX6，EC: 3.6.4.13)、U6 核内小RNA相关的类Sm蛋白(LSM8)基因均在指数期、稳定期和衰亡期显著差异表达。如图1 (c)、(d) 所示，与RNA的加工和降解过程相关的PNPT在稳定期和衰亡期的Lf值均显著高于指数期，分别为3.32和3.87。在mRNA降解过程中发挥重要作用的CNOT6在衰亡期的Lf值显著高于指数期，Lf值为1.66。图1(e)中，XRN2在稳定期和衰亡期的Lf值分别为2.68和3.55，均显著高于指数期。DDX6在稳定期、衰亡期的Lf值显著低于指数期，分别为-4.42和-2.81(见图1(f))。与RNA的合成过程有关的LSM8在稳定期的Lf值(-3.70)显著低于指数期(见图1(h))，表明在稳定期RNA的合成速率可能显著低于指数期。XRN2和PNPT基因的高表达，能够显著促进miRNAs的降解[32]。上述结果表明，在稳定期与衰亡期，与RNA降解过程相关的PNPT、CNOT6、XRN2、 DDX6和LSM8基因转录组水平表达量与指数期存在显著差异，表明藻细胞RNA降解速率可能加快，正常的生命活动过程受到阻碍，促进了细胞死亡过程的发生。

细胞周期蛋白B1和细胞周期蛋白B2(cyclin B，EC: 2.7.11.22)基因的表达在稳定期的Lf值显著低于指数期，分别为-4.20和-3.87(见图1(h)、(i))，而且细胞周期蛋白B2在衰亡期的Lf值显著低于指数期，为-3.21，表明藻细胞增殖能力在稳定期和衰亡期可能已经显著降低。分子伴侣GroEL(EC: 3.6.4.9)在稳定期和衰亡期的Lf值均显著高于指数期，分别为5.65和5.75(见图1(j))，该基因为许多蛋白正确折叠所必须，其高表达能够促进在胁迫条件时错误折叠多肽的重新折叠。烯醇化酶1 (Enolase 1，EC: 4.2.1.11)在稳定期的Lf值(1.84)显著高于指数期 (见图1(k))，表明在稳定期藻细胞可能加快了糖酵解过程，促进能量的产生与释放，为生命活动提供能量保障。

细胞死亡特异蛋白已经在中肋骨条藻和假微型海链藻中发现[29-30]。在多细胞动物中，细胞死亡蛋白能够促使细胞内钙稳态失衡，进而损伤细胞并活化不同的钙离子调控蛋白致使细胞死亡[33]。衰老及光限制时，中肋骨条藻(Skeletonemacostatum)的死亡特异蛋白基因均能被诱导高表达[29]。死亡特异蛋白Lf值在衰亡期显著高于指数期，为2.34(见图1(l))，表明在衰亡期胞内钙离子稳态可能已经遭到破坏，细胞死亡百分比显著升高。

综上所述，玛氏骨条藻在不同生长时期与抗氧化胁迫作用相关的关键酶(如过氧化物酶5、铜锌超氧化物歧化酶)、与RNA的加工与降解过程有关的功能基因(如多核糖核苷酸核苷转移酶、5’～3’核糖核酸外切酶 2)以及细胞死亡特异蛋白等基因表达水平的变化体现了藻体在应对不同生长时期胁迫时做出的分子响应，同时指征细胞死亡亦可能与PCD相关，可以作为后续研究重点。浮游植物死亡的调控是影响微生物动态和多样性、物种演替以及生源要素生物地球化学循环的重要因素[34-35]，认识并阐明浮游植物细胞死亡的分子机制对于认识赤潮持续和消亡的分子机理，探究种群动态变化和物质循环过程都具有重要意义。

3 结语

本研究通过对玛氏骨条藻转录组测序与分析，发现玛氏骨条藻中存在26个与细胞死亡相关的酶以及37个编码这些酶的基因。序列比对结果表明，这些编码基因与同属中心纲的假微型海链藻和大洋海链藻有较高的序列一致性。通过比较玛氏骨条藻不同生长时期的转录组，发现与细胞死亡相关的一些功能基因存在显著差异表达。相比于指数期，与抗氧化胁迫作用相关的关键酶(如过氧化物酶5、铜锌超氧化物歧化酶)、与RNA的加工与降解过程有关的功能基因(如多核糖核苷酸核苷转移酶、5’～3’核糖核酸外切酶 2)以及DSP基因在稳定期和衰亡期显著差异表达，为蛋白水平研究提供一种可能性变化趋势和潜在数据依据，同时为以后研究提供数据基础及研究方向。本实验结果为进一步深入研究赤潮藻在遭受环境胁迫时细胞死亡相关基因的表达调控模式奠定了基础。

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责任编辑 高 蓓

Description of Functional Genes Related to Cell Death Based onSkeletonemamarinoiTranscriptome

WANG Hua-Long1,2,4, MI Tie-Zhu2,4, ZHEN Yu2,4, LIU Qian1,2,4, YU Zhi-Gang3,4

(1.College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2.The Key Laboratory of Marine Environment and Ecology, Ministry of Education, Qingdao 266100, China; 3.The Key Laboratory of Marine Chemical Theory and Technology, Ministry of Education, Qingdao 266100, China; 4.Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China)

The transcriptome ofSkeletonemamarinoiat different growth stages was analyzed with Illumina-Hiseq2000 platform sequencing technology, producing and identifying 39 098 transcripts. Assembled sequences were subjected to NR BLAST similarity searches and Kyoto Encyclopedia of Genes and annotated with Gene Ontology (GO) and Genomes orthology (KO) identifiers. These analyses identified many important metabolic pathways and functional genes ofS.marinoi, especially the functional genes related to cell death ofS.marinoiinvolving 26 enzymes and 37 coding genes was analyzed and constructed on the basis of its transcriptome data. Comparative analysis of the homologous genes ofS.marinoi,ThalassiosiraoceanicaandThalassiosirapseudonanawith BLASTx method, the results showed relatively high homologous genes betweenT.pseudonanaandS.marinoi. The gene differential expression related to cell death ofS.marinoiwas identified at different growth stages using digital gene expression profiling. Key enzymes related to antioxidant stress (peroxiredoxin 5,superoxide dismutase, Cu-Zn family), RNA processing and degradation (polyribonucleotide nucleotidyltransferase, 5'～3' exoribonuclease 2) and death specific protein (DSP) in stationary phase and decline phase were significantly higher compared to exponential growth phase. The expression of Cu-Zn-SOD gene was significantly lower in stationary phase and decline phase than in the exponential phase (stationary phase and decline phase log2(Fold Change) was -5.03 and -2.93; exponential phase log2(Fold Change) was 0). The gene expression of polyribonucleotide nucleotidyltransferase was significantly higher in stationary phase and decline phase than in the exponential phase (stationary phase and decline phase log2(Fold Change) was 3.32 and 3.87; exponential phase log2(Fold Change) was 0). The gene expression of DSP was significantly higher in decline phase than in the exponential phase (decline phase log2(Fold Change) was 2.34; exponential phase log2(Fold Change) was 0). The results indicated the different responses of functional genes related to cell death ofS.marinoiin different growth phases. Our study will contribute to analyze the protein expression, and provideing the basis of future research and new sight. Our study will contribute to analyze gene regulation of key enzymes related to cell death ofS.marinoi, and providing a basis to enhance our knowledge about gene expression and regulation mechanism in diatom cell death, which will be beneficial to in-depth understand the cell death of the harmful algae bloom decay.

Skeletonemamarinoi; RNA-seq; cell death

国家自然科学基金项目(41521064)；海洋公益性行业科研专项(201205031)；山东省自然科学基金项目(ZR2014DM007)资助

2016-06-08；

2016-09-15

王华龙(1989-)，男，博士生。E-mail: wanghualong90@163.com

** 通讯作者：E-mail: mitiezhu@ouc.edu.cn

Q178.53

A

1672-5174(2017)04-058-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20160210

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Supported by the National Natural Science Foundation of China (41521064); Public Science and Technology Research Funds Projects of Ocean (201205031); National Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2014DM007)