尹周 严晓铭 综述 薛群 审校

外泌体介导神经免疫与多发性硬化

尹周 严晓铭 综述 薛群 审校

目的 外泌体颗粒内部和表面均携带活性膜蛋白、脂质和遗传物质，这些物质可进行信息传递，参与多种生物信号通路，如免疫应答、炎性反应等过程。研究结果显示，外泌体在多发性硬化(MS)等多种自身免疫性疾病中含量明显增加，可作为潜在的信息载体参与MS的生理病理过程，但其具体作用及机制尚不清楚。外泌体信号在细胞与细胞间的传导加深了人们对MS发生、发展的认识，同时为MS和其他神经免疫性疾病的治疗和干预提供了新的策略。本文主要就外泌体在免疫细胞和神经细胞之间炎性反应诱导和炎性反应扩散的作用进行综述，并就外泌体对MS发生和发展的影响以及其在MS诊断和治疗中的作用做一介绍。

多发性硬化；外泌体；神经免疫；发病机制

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是发生在中枢神经系统(CNS)的自身免疫性疾病，其病理特点是髓鞘脱失并伴有大量炎性细胞浸润，进而引起神经功能障碍。多项研究结果显示MS与遗传易患基因、环境因素、免疫稳态等多因素有关，但其发病机制仍不完全明确。近年来研究证实外泌体(exosomes)参与MS的多个生理病理过程，同时，外泌体介导的炎性反应可以破坏血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)，主要是通过周围炎性细胞释放含有干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)等炎性细胞因子有关的外泌体[1]。如IFN-γ可改变BBB脑内皮细胞之间的组织结构和紧密性，TNF-α和IL-1β通过表达一氧化氮合酶破坏BBB[2]。BBB紧密性的破坏可使白细胞迁移至CNS内，进而引起髓鞘脱失[3]。此外，小胶质细胞产生的外泌体含有 IL-1β和Ⅱ型主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC-Ⅱ)，也可促进神经炎性扩散，促进MS的进展。外泌体不仅直接影响MS的生理病理过程，而且可预示疾病的发展状况，提示外泌体可能成为MS发病机制潜在的生物标志物和治疗靶点[4]。

1 外泌体特性与生物学功能

外泌体是一种直径约30～100 nm的膜性小囊泡，来源于晚期胞内体〔也称多泡体(multivesi-cular bodies)〕，电镜下呈双凹圆盘状或杯口状[5]。外泌体不同于一般的凋亡小体，是在细胞内吞系统中形成、分泌和释放[6]。活细胞通过内吞途径将原始胞内小泡等内吞物质转变为内吞小体，融合成早期胞内体。在早期胞内体成熟过程中，管腔内囊泡(intraluminal vesicles)中的内含物质和表面分子构成发生极大变化，蛋白和信号复合物聚集在多泡体内膜上，通过多泡体膜内陷选择性地与管腔内囊泡融合[7]，随后多泡体内的小囊泡进入细胞外环境中形成外泌体。研究证实外泌体中含有mRNA、microRNA、蛋白质和信号复合物等物质，有些是所有外泌体共同标记分子，如热休克蛋白70[8]，而有些则是依赖于它们所分泌的细胞类型[7]，如抗原递呈细胞释放的外泌体携带的主要是MHC，而少突胶质细胞释放的外泌体可携带髓鞘蛋白[9]。这些囊泡可由体内和体外培养的活细胞分泌而来，如神经系统中的神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞，同时也存在于脑脊液中[10]。

研究证实外泌体是细胞间交流的特殊媒介[11-12]，神经元和胶质细胞可借助外泌体实现物质的转移和信号的传递，形成精密高效的信号传导系统。如神经元来源的外泌体受钙内流和突触谷氨酸能突触活性的影响[13]，同时神经元可通过释放信号提高少突胶质细胞内Ca2+通道的通透性以促进少突胶质细胞外泌体的释放[14]，且少突胶质细胞释放的外泌体能被邻近神经元通过内吞作用内化[15]。此外神经元还能调节胶质细胞外泌体对其自身蛋白、mRNA和miRNAs的供应[14]。在氧化应激条件下，胶质细胞来源的外泌体可通过抑制神经元与胶质细胞的黏附并释放突触蛋白Ⅰ促进轴突生长和神经元存活[16]。星形胶质细胞释放的外泌体也可能影响神经元的存活，小胶质细胞可清除其他神经胶质细胞释放的多余外泌体，选择性激活炎性反应，影响突触活性[17]。

在病理刺激或损伤情况下，外泌体可表现出免疫刺激特性而活化和传递炎性反应[18]，进而影响神经系统功能。如树突状细胞分泌的外泌体表达MHC-Ⅱ类分子，可结合抗原肽形成MHC-抗原肽复合物，促进T细胞活化[18-19]。感染的巨噬细胞可释放外泌体并表达病原相关模式分子，通过模式识别受体刺激巨噬细胞活化，进而促进炎性反应[20]。此外，外泌体也包含促炎性反应介质(如IL-1β和TNF-α)，其对炎性反应的调节和扩散起到重要作用[18-19]。适当的炎性反应有利于组织修复，但过度或持久的炎性反应可引起慢性或更为严重的神经炎性反应，促进疾病进展[21]。总之，上述证据表明，外泌体不仅可诱导和调节炎性反应，而且可以促进炎性反应扩散，在神经免疫应答中发挥重要作用。

2 外泌体信号转导与BBB的破坏

目前认为MS发病机制的始动因素是免疫细胞的异常活化，并透过BBB进入CNS。在多种因素下免疫系统的异常激活可使免疫细胞释放外泌体(如内皮细胞、血小板、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞)，其释放的囊泡均参与MS的发病机制[3]。内皮细胞释放的外泌体不但可以在缺少其他任何刺激信号下激活CD4+和CD8+T细胞产生神经毒性，而且可以作为潜在启动自身免疫性脑病的初始步骤[22]。另外，内皮细胞来源的囊泡携带金属蛋白酶不仅可以促进BBB损伤[23]，而且可以诱导血管内皮细胞活化，活化的血管内皮细胞可以表达不同的选择素，通过与 T淋巴细胞表达的配体结合介导 T细胞的边集，使T细胞得到趋化信号，促进淋巴细胞进入CNS。MS患者血小板来源的囊泡与血管内皮细胞分泌的外泌体具有类似的作用，血小板分泌的囊泡表面表达P-选择素可以增加细胞黏附分子极迟抗原-4(very late antigen-4，VLA-4)的表达[3]，与淋巴细胞表达的细胞黏附分子P-选凝素糖蛋白配基-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PSGL-1)和血小板内皮细胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1)相结合，进而促进淋巴细胞与内皮细胞的结合[24]。同时，血小板衍生的囊泡还可显著增加脑内皮细胞层的通透能力，参与BBB的破坏[25]。

已有研究表明，趋化因子CCL5、γ干扰素诱生蛋白10(IP-10)和单核细胞趋化蛋白(MCP-1)均是与MS发病有关的趋化因子，应用相应的抗体可抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的进展。活化的T细胞释放的外泌体含有趋化因子CCL5和花生四烯酸，可以募集单核细胞，并可以上调细胞间黏附分子(ICAM)和淋巴细胞功能相关抗原(LFA-1)[3]。 ICAM/LFA-1 之间的相互作用可调节T淋巴细胞的滚动、黏附和渗入，一旦BBB发生炎性改变，ICAM/LFA-1可发生相互作用，并与 CD4+T细胞的MHC-Ⅱ型分子结合，进而促使自身反应性T细胞渗出血管内皮进入CNS[1]，启动MS的发生和发展。

3 外泌体信号转导与MS进展

越来越多的研究证实，免疫细胞释放的外泌体具有免疫刺激特性，对免疫细胞的活化和炎性反应的播散起到推动作用[18]，促进MS的发生和发展。BBB的损伤可影响其通透性，促进单核细胞和T淋巴细胞的活化，黏附和跨膜迁移进入CNS[26]。如果自身反应性 T细胞一旦获得进入CNS的通路，就可以通过自身分泌基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)降解血管基底膜的Ⅳ型胶原，尤其是MMP-9可以辅助淋巴细胞穿透细胞外基质(extracellular matrix，ECM)。其次，单核细胞和小胶质细胞释放的外泌体携带胱天蛋白酶1(caspases 1)，可调节MMPs的蛋白水解活性[27]，促使许多重要的分子前体迅速通过蛋白溶解过程，转变为活性形式，如细胞因子TNF-α或TNF-β前体、细胞因子受体IL6R和血管细胞黏附因子。这些细胞因子的活化使BBB破坏进一步加重，使潜在致病性的细胞和抗体很快进入CNS，加重组织破坏程度。

研究发现MS患者脑脊液和血液中外泌体水平明显增加，这些外泌体囊泡含有IL1-β、MHC-Ⅱ等其他炎性成分[28]，在炎性反应因子的作用下Th17/Treg平衡被打破而诱发MS[29]，同时滤泡辅助性T细胞(Tfh)在炎性信号的影响下产生IL-21、IL-10等细胞因子，辅助异位淋巴滤泡中的B细胞分化成浆细胞并产生抗体[30]，进而促进MS发展。MS病变部位释放含有细胞因子和趋化因子的外泌体可以募集胶质细胞、巨噬细胞和淋巴细胞，引起持续的免疫激活反应从而导致慢性炎性反应过程[31]。实验证实，将小胶质细胞分泌的外泌体注射到EAE模型小鼠大脑可发现大量的炎性细胞向注射部位募集[32]。在MS患者中，活化内皮细胞脱落的囊泡可促进单核细胞和淋巴细胞的迁移穿过BBB，并辅助形成脱髓鞘病灶。这一假说由Jimenez等[33]实验证实：通过给予大鼠脑微血管内皮细胞(microvascular endothelial cell，MVEC)模型注射缓解或复发性MS患者和对照组的血浆，发现只有复发患者的血浆可明显促进淋巴细胞跨内皮迁移。

综上所述，这些含有炎性介质的外泌体通过多种途径引起BBB损伤，大量的免疫细胞迁移透过BBB进入CNS，同时分泌的囊泡将信号传递至CNS内，引起脑内皮细胞、小胶质细胞等细胞产生含有趋化因子、整合素等促炎性分子的外泌体。通过免疫细胞与神经细胞之间的多重相互作用引起炎性反应的进展与播散，从而进一步加重BBB的破坏和神经功能的损伤。外泌体的信号传递可能通过免疫细胞与胶质细胞和胶质细胞与神经细胞之间的联系引起炎症反应的播散，启动并发展为MS。

4 外泌体与MS的诊断

外泌体可间接反映脑内细胞的状态，据此推测其可能含有神经免疫性疾病早期生化改变的关键信息。人脑脊液外泌体蛋白组学研究发现外泌体含有大量标记性蛋白，如热休克蛋白、四跨膜超家族蛋白和脑内衍生蛋白等，其揭示了外泌体可作为生物标记物的潜力[34]。

研究证实，外泌体与“毒性”蛋白在大脑内的播散和多种神经变性疾病的进展有关[35]。目前许多关于外泌体的研究集中于细胞外的miRNA功能，miR-122惟一被证实与MS相关[36]。最近一项研究结果显示，幼龄大鼠产生的血清外泌体可明显增加髓磷脂含量，增加少突胶质前体细胞水平和神经干细胞水平，减少海马区氧化应激反应[37]，这些含有高浓度的miR-219外泌体在紧密髓磷脂的形成与维持中起着重要作用[38-39]，然而在人类MS患者中缺乏相关miR-219的外泌体[40]。

MS患者脑脊液中外泌体的含量明显高于健康人，在急性期小胶质细胞衍生的囊泡的数量高于病情稳定或慢性期阶段，并且内皮细胞分泌的外泌体联合CD31浓度的检测对MS的临床诊断与钆增强磁共振成像相比具有更高的灵敏度[3]。另一项研究显示，复发-缓解型MS患者脑脊液中骨髓细胞衍生的囊泡(IB4+)水平与健康对照组相比明显增加[32]，相对稳定或慢性阶段而言，急性阶段脑脊液中外泌体的含量明显增高。其次，外泌体在脑脊液中的含量与MRI检测病损程度呈线性相关[35]。因此，无论发病高峰或临床复发，还是慢性阶段，脑脊液中外泌体浓度很好地反映出疾病的过程和严重程度。

5 外泌体与MS的治疗

由于BBB限制了98%的蛋白成分药物不能透过BBB，进而影响CNS疾病的治疗[41]。虽然目前已经研制出不同纳米颗粒的药物，但仍面临纳米毒性和快速清除的挑战[42]。而外泌体可以越过BBB，并可有效地减少药物清除率[43]。在MS的治疗中，经过修饰的外泌体可递送相关信息促进髓鞘再生[44]。例如EAE孕鼠血清外泌体能抑制淋巴细胞增殖而促进少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells)增殖和迁移，其原因可能与白血病抑制因子受体(leukemia inhibitory factor receptor)穿过BBB后嵌入少突胶质前体细胞质膜介导白血病抑制因子信号有关[45]，从而保护EAE轴突及促进髓鞘再生。此外，无论在体外或体内，IFN-γ刺激树突状细胞分泌的外泌体含有大量的miR219分子，可以增加髓鞘形成和氧化应激的耐受性[44]，这些含有高浓度抗炎miRNA分子的外泌体可能在抑制MS的发展中起到免疫调节的作用[44，46]。因此，外泌体自身不仅可作为治疗药物，而且可作为结合药物的载体，满足精准医疗的需求。

综上所述，MS的发生可能主要通过周围的炎性细胞释放含有促炎细胞因子的外泌体介导炎性反应，破坏BBB进而使白细胞边集、渗出、迁移至CNS内。同时促进神经炎性反应扩散，进而引起髓鞘脱失、神经元损伤，发生神经功能障碍，推进MS的发展。外泌体参与细胞与细胞间信号的传导，在促进炎性反应进展中扮演重要的角色。深化对外泌体相关免疫信号转导的研究将为进一步阐明MS发病机制提供新的见解和认识，为MS的诊断和治疗干预提供新思路。

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(本文编辑：时秋宽)

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.04.012

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