闫路路， 王昭萍❋❋， 苏家齐， 闫喜武， 于瑞海(.海水养殖教育部重点实验室(中国海洋大学)，山东 青岛 6600；.中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部南海渔业资源开发利用重点实验室,南海资源开发与保护协同创新中心，广东 广州 5000；.大连海洋大学水产与生命学院，辽宁省贝类良种繁育工程技术研究中心，辽宁 大连 60)

熊本牡蛎(♀)×葡萄牙牡蛎(♂)杂交子代的营养成分和脂肪代谢相关基因表达分析❋

闫路路1， 王昭萍1❋❋， 苏家齐2， 闫喜武3， 于瑞海1
(1.海水养殖教育部重点实验室(中国海洋大学)，山东 青岛 266003；2.中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部南海渔业资源开发利用重点实验室,南海资源开发与保护协同创新中心，广东 广州 510300；3.大连海洋大学水产与生命学院，辽宁省贝类良种繁育工程技术研究中心，辽宁 大连 116023)

本研究分析了熊本牡蛎(♀)×葡萄牙牡蛎(♂)杂交子代和自繁子代的基本营养成分、氨基酸含量、脂肪酸成分和脂肪相关基因的表达。研究发现，杂交子代牡蛎的脂肪含量为(13.66±1.99)%，显著高于自繁子代；脂肪酸成分分析中，杂交子代ω3/ω6多不饱和脂肪酸的比例为4.18±0.62，高于自繁子代；DHA含量为(16.73±3.35)%，高于自繁子代但与自繁子代的差异不显著，EPA含量介于2种自繁子代之间；在脂肪相关基因表达方面，PPARα、INSIG和SREBP基因在部分可食用组织中的表达结果与子代中脂肪含量比较的结果相吻合杂交子代的脂肪含量显著高于自繁子代的脂肪含量。结果表明，熊本牡蛎与葡萄牙牡蛎的杂交子代在脂肪含量和脂肪酸结构上存在一定的杂种优势。

熊本牡蛎；葡萄牙牡蛎；杂交牡蛎；营养成分；基因表达

牡蛎属于软体动物门(Mollusca)双壳纲(Bivalvia)珍珠贝目(Pterioida)牡蛎科(Ostreidae)，为全球性分布类群；是一种重要的海洋生物资源，更是世界上最重要的海水养殖经济类群之一，其养殖总产量和单位面积产量在所有的贝类养殖种类中位居首位[1]。牡蛎肉质鲜美，营养价值丰富，具有丰富的蛋白质、氨基酸、多不饱和脂肪酸、微量元素和矿物质等，具有极高的食用价值和药用价值。同时，很多学者在不同牡蛎的营养成分方面做了较多的研究，如长牡蛎(Crassostreagigas)[2]、近江牡蛎(C.rivularis)[3]、褶牡蛎(C.plicatula)[4]、红树林牡蛎(C.corteziensis)[5]等，这为牡蛎产业尤其是养殖业的发展提供了较丰富的实践参考和理论支持。

杂交育种在水产养殖上的应用十分广泛，主要用于水产动物育种中提高生长速度、抗病力、抗逆性、含肉率、饲料转化率、成活率以及改良肉质、创造新品种、保存和发展有益的突变体、抢救濒于灭绝的良种等[6]。近年来贝类杂交逐渐得到各国育种学家的重视并取得了一定的成果，牡蛎杂交可以促进种间基因交流，引入异种有利基因，形成优势新物种[7]。近年来，学者们开展了多种牡蛎的种间杂交组合，如长牡蛎(C.gigas)×葡萄牙牡蛎(C.angulata)[8]、有明牡蛎(C.ariakensis)×熊本牡蛎(C.sikamea)[9]、长牡蛎(C.gigas)×美洲牡蛎(C.virginica)[10]等。并且发现部分杂交组合的牡蛎如香港牡蛎(C.hongkongensis)×葡萄牙牡蛎(C.angulata)[11]，熊本牡蛎(C.sikamea)×葡萄牙牡蛎(C.angulata)(待发表)在生长、存活等方面存在一定的杂交优势。目前，国内外对牡蛎杂交的研究主要集中在生长、存活、对环境因子的适应性以及育性等方面，而相关的营养、生理调控和基因水平上的转录调控等方面的研究还处于空白，限制了牡蛎杂交技术的发展提高和应用推广。

本文对一龄的葡萄牙牡蛎、熊本牡蛎以及熊本牡蛎(♀)与葡萄牙牡蛎(♂)杂交获得的子一代杂交牡蛎进行了营养成分分析，分别比较了这3种牡蛎的基本营养成分、氨基酸含量、脂肪酸成分。另外通过荧光定量PCR，检测了3种牡蛎组织中的脂代谢相关基因表达。本研究结果将为牡蛎杂交育种方向上的研究和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

熊本牡蛎和葡萄牙牡蛎的杂交子代与自繁子代为本实验室于2014年7月至2015年7月间培育的一龄牡蛎，在北海育苗场进行养成。本实验用的一龄熊本牡蛎、葡萄牙牡蛎和杂交子代牡蛎的壳高分别为(35.79±2.00)、(58.03±2.00)和(44.46±2.00)cm。

1.2 样品处理

将每种30个解剖，整体取出、捣碎、混匀，一部分低温烘干，105℃继续烘干，密封保存，并置于干燥器中，用于除糖原外的一般营养成分分析和氨基酸测定；另一部分冷冻干燥，用于糖原和脂肪酸测定。另外分别解剖3个牡蛎，按照外套膜、性腺、闭壳肌和内脏团4种组织进行解剖，分别装入冻存管中，迅速冷冻在液氮中，于-80℃冰箱中冷冻保存，用于脂肪相关基因的绝对定量实验。本实验中所有牡蛎均根据Haiyan Wang等[12]报道的方法进行物种鉴定，确认后方可进行后续检测与定量实验。

1.3 营养成分测定方法

依据南京建成考马斯亮蓝测试盒说明书，测定牡蛎中总蛋白；依据GB/T 5009.6-2003，索氏提取法测定粗脂肪；依据GB 5009.3-2010，105℃常压干燥法测定水分；依据蒽酮硫酸法测定糖原；依据GB/T 5009.124-2003，使用日立L-8900全自动氨基酸分析仪测定氨基酸成分；样品经皂化、甲酯化后，采用岛津GC-2010气相色谱测定脂肪酸。

根据FAO/WHO(1981)修订的人体必需氨基酸均衡模式进行比较，氨基酸评分指待测蛋白质中必需氨基酸与理想氨基酸或参考蛋白质中相应的必须氨基酸的比值[13]。计算公式为：AAS=食物中每克蛋白质中氨基酸含量(mg)/理想模式或参考蛋白质中每克蛋白质中氨基酸含量(mg)×100%。

1.4 总RNA的提取和反转录

用Trizol Reagent试剂分别提取牡蛎4个组织中的总RNA，并用DNase I去除DNA。用1.2%的琼脂糖凝胶电泳对RNA的完整性进行检测，确保无弥散现象。用NonoDrop2000测定总RNA的浓度和纯度，A260/280介于1.9～2.1之间的RNA认为纯度合格。取900 ng总RNA按照PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒说明书方法合成cDNA第一链，分装保存于-20℃。

1.5 引物来源

根据本实验室所得的胰岛素诱导基因(INSIG)序列设计荧光定量引物。固醇调节元件结合蛋白基因(SREBP)和过氧化物酶体增殖物激活受体基因(PPARα)引物序列来自于文献[14-15](见表1)。

1.6 绝对定量标准品制备

将纯化的各基因目的片段与Peasy-T1克隆载体链接后转化到Trans1-T1 Phage Resistant感受态细胞中，通过蓝白斑筛选制备阳性标准单克隆质粒。挑取单克隆白斑，37℃摇菌16h后提取质粒，经PCR鉴定后进行质粒测序，并将测序结果与NCBI数据库比对。

根据公式：质粒拷贝数(copies/μL)=6.02×1023(copies/mol)×质粒浓度(g/μL)/质粒分子量(g/mol)，计算质粒拷贝数。按终浓度为109、108、107、106、105和104copies/μL分别进行稀释，并作为标准质粒进行Real-time PCR扩增。

1.7 实时荧光定量PCR

实验所用仪器为Roche罗氏LightCycler®480荧光定量PCR仪，数据分析采用罗氏公司提供的二阶导数法进行绝对定量分析。

本实验采用TaKaRa公司的提供的SYBR® Premix Ex TaqTM II(TliRNaseH Plus)试剂盒进行实时荧光定量PCR。反应体系为20μL，其中模板2 μL，上下游引物各0.8 μL(终浓度0.4 μmol/L)，SYBR Premix Ex Taq II(TliRNaseH Plus)(2×)10 μL，dH2O灭菌水6.4 μL。反应条件为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。反应结束后，对PCR产物进行溶解曲线检验，确保产物为单峰。并将产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，确保产物只有单一条带。

1.8 数据处理

各测定项目数值以平均值±标准差(Mean±SD)表示。用SPSS18.0统计软件对数据进行分析处理,不同实验组间实验结果数据差异性的比较采用单因素方差分析方法(Duncan LSD)，差异显著性设置为P<0.05。

2 结果与讨论

2.1 基本营养成分含量比较

由表2可知，熊本牡蛎(SS)、葡萄牙牡蛎(AA)和它们的杂交子代(SA)的蛋白含量均占干重的49%以上；脂肪在杂交子代中含量最高，占干重的(13.66±1.99)%，显著高于熊本牡蛎(7.56±1.17)%和葡萄牙牡蛎(5.94±1.88)%，表现出一定的杂种优势(P<0.05)；3种牡蛎的糖原含量在4.94%～5.84%之间，葡萄牙牡蛎糖原含量最高为(5.84±0.85)%，杂交子代介于2种自繁子代之间，三者没有显著差异；水分含量在杂交子代SA中含量最低，为(74.66±3.86)%，低于熊本牡蛎和葡萄牙牡蛎但差异不显著。

注：表中总蛋白、粗脂肪、糖原含量为干重百分比；水分为湿重百分比；*表示差异显著，P<0.05，下同。SS：熊本牡蛎；AA：葡萄牙牡蛎；SA：熊本牡蛎与葡萄牙牡蛎的杂交子代，下同。

Note:the contents of protein,fat and glycogen are the percentage of dry weight;moisture composition is the percentage of wet weight;*means significant test,P<0.05,the same below.SS meansC.sikamea,AA meansC.angulata,SA was their hybrid oyster, the same below.

2.2 氨基酸组成分析

实验检测了熊本牡蛎、葡萄牙牡蛎及其杂交子代整体的氨基酸含量，结果详见表3。由表3可见3种牡蛎氨基酸含量较为丰富，经LSD多重分析发现3种牡蛎氨基酸含量无显著差异，总氨基酸含量在51.89%～54.56%之间，必需氨基酸含量均占到19.85%以上，非必需氨基酸含量在26.58%～27.91%之间，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值均在70%以上，超过FAO/WHO标准的60%。

实验根据FAO/WHO标准模式，对除色氨酸外的7种必需氨基酸进行评分(见表4)。除蛋氨酸+半胱氨酸评分低于100，其他氨基酸评分均在100以上，最高的是赖氨酸，在163.80～183.30之间。其中，葡萄牙牡蛎的异亮氨酸评分为135.00±1.08，显著高于其他2组(P<0.05)。由以上结果判定，此3种牡蛎在氨基酸含量和氨基酸组成上均没有显著差异，且都属于优质的蛋白质食物。

注：*表示差异显著。*means significant test.

2.3 脂肪酸组成分析

由基本营养成分分析可知，杂交子代SA在脂肪含量上表现出一定的杂种优势，为进一步探索杂交子代与亲本子代在脂肪酸中的差异，于是本实验对熊本牡蛎SS、葡萄牙牡蛎AA和杂交子代SA在脂肪酸组成成分及含量方面进行分析。

从脂肪酸组成看，熊本牡蛎和葡萄牙牡蛎的杂交子代和自繁子代中均含有19种脂肪酸(见表5)。饱和脂肪酸(SFA)5种，占总脂肪酸的32.38%～36.42%。不饱和脂肪酸(UFA)14种，在脂肪酸中占主导地位，含量在63.28%～66.76%之间，其中单不饱和脂肪酸(MUFA)4种，占脂肪酸含量的22.75%～24.50%；多不饱和脂肪酸(PUFA)10种，占40.16%～42.56%。在5种饱和脂肪酸中，碳原子数目较少的软脂酸(16:0)和硬脂酸(18:0)占主导地位，杂交子代中软脂酸(16:0)含量高于自繁子代。在单不饱和脂肪酸中，花生一烯酸(20:1)和油酸(18:1)含量最高，杂交子代中花生一烯酸(20:1)含量介于2种自繁子代之间，无显著差异；油酸(18:1)含量高于2种自繁子代，并且显著高于葡萄牙牡蛎(P<0.05)。10种不饱和脂肪酸包括4种ω6族脂肪酸，5种ω3族脂肪酸。ω6脂肪酸主要从植物油和肉之中获得，ω3主要从海产品中获得[16]。ω3和ω6脂肪摄入的失衡，即ω6/ω3多不饱和脂肪酸的比例过高，会造成人体内环境紊乱，引发疾病[17]。本实验中，杂交子代的ω3/ω6多不饱和脂肪酸的比例为4.18±0.62，高于熊本牡蛎(3.86±0.01)和葡萄牙牡蛎(3.14±0.07)，同时杂交子代中ω6族脂肪酸含量显著低于葡萄牙牡蛎(P<0.05)。可以看出，杂交子代的多不饱和脂肪酸营养成分(ω3/ω6脂肪酸比例)更适合人类对ω3脂肪酸的摄入，可以防止摄入过多的ω6脂肪酸而导致人体内环境的紊乱。

在ω3族脂肪酸中，含量最高的是EPA(20:5ω3)和DHA(22:6ω3)。牡蛎杂交子代中DHA含量高于自繁子代牡蛎，EPA含量介于2种自繁子代之间，同时DHA与EPA的总和在杂交子代牡蛎脂肪酸中占(26.03±4.32)%，仅次于熊本牡蛎的(26.15±0.74)%，含量最低的为葡萄牙牡蛎，占(21.46±1.80)%。由于DHA和EPA对心脑血管等疾病有一定的预防和改善作用，所以它们经常作为衡量脂肪价值的重要指标[3,18]。实验显示，3种牡蛎不饱和脂肪酸含量均较高，有益于心血管疾病患者和其他高风险人群(如中老年人)，从补充EPA和DHA角度考虑，熊本牡蛎和杂交子代优于葡萄牙牡蛎。由于3种牡蛎在相同的海区育成，所以可以排除由于摄取了不同营养成分的藻类(如硅藻类含有大量EPA，鞭毛藻类含有大量DHA和EPA[19-21])而导致的脂肪酸差异，推测这种差异有可能来自于不同种牡蛎间固有的物种特异性。杂交子代的EPA含量接近于熊本牡蛎，高于葡萄牙牡蛎，并且DHA含量高于熊本牡蛎和葡萄牙牡蛎，这可能是由于杂交子代在EPA的合成方面遗传了母本熊本牡蛎高EPA的特性，同时在DHA含量上表现出了很好的杂种优势。

注：SFA：饱和脂肪酸；UFO：不饱和脂肪酸；MUFA：单不饱和脂肪酸；PUFA：多不饱和脂肪酸。不同的上标字母代表差异显著(P<0.05)。

Note:SFA:saturated fatty acid;UFO:unsaturated fatty acid;MUFA:monounsaturated fatty acid;PUFA:polyunsaturated fatty acids.Means with different letters denote significant differences atP<0.05.

2.4 脂肪相关基因绝对表达量分析

由粗脂肪测定和脂肪酸成分分析可知，3种牡蛎在脂肪含量和脂肪酸组成上确实存在一定差异，为探究这一差异在牡蛎各组织中的转录情况，本实验中对3种脂肪相关基因，即过氧化物酶体增殖物激活受体基因(PPARα)、固醇调节元件结合蛋白基因(SREBP1)和基因胰岛素诱导基因(INSIG)，分别进行绝对荧光定量。实验中，3个基因的PCR产物测序序列均能比对到目的基因的注释信息，各基因标准质粒的标准曲线相关系数均大于0.990。经标准曲线绝对定量，3个基因在不同种牡蛎的主要可食用组织(闭壳肌、外套膜、性腺)及内脏团中的基础表达量存在显著差异(见图1)。

PPARα是一种配体激活转录因子，在肝脏、心脏、肌肉和巨噬细胞的调节脂质代谢平衡中起重要作用[22]。PPARα可以激活脂肪酸新陈代谢，刺激糖质新生和酮体的合成，并且能够控制脂蛋白的合成[23]。有研究表明，PPARα可以促进生物体脂肪酸的β氧化过程[24]，降低脂肪积累。而在肠组织中，PPARα可以降低胆固醇的酯化，抑制乳糜微粒的生成，并增加高密度脂蛋白(High-density lipoprotein, HDL)含量[25]。本实验中，杂交子代的外套膜和闭壳肌中PPARα的表达量最低，显著低于熊本牡蛎和葡萄牙牡蛎，即SA中PPARα表达量低于自繁子代，则在这些组织中受PPARα介导的脂肪酸β氧化作用也低于自繁子代，从而自繁子代中的脂肪酸可以适量积累。总体来说，牡蛎中主要可食用部分外套膜、性腺、闭壳肌的重量占牡蛎软体部重量的绝大部分，这与杂交子代牡蛎SA的粗脂肪含量显著高于自繁子代SS和AA这一实验结果相符。而在内脏团中，杂交子代的PPARα的表达量最高，显著高于熊本牡蛎和葡萄牙牡蛎，表明了杂交子代可能在脂肪的消化吸收过程中，转化HDL的能力要高于自繁子代。与哺乳动物等高等动物不同，水生生物如鱼类中血浆HDL所占的比例最大、浓度最高，低密度脂蛋白浓度明显低于HDL。血浆中高浓度的HDL表明外周组织向肝脏转运胆固醇的速率较快[26]。在对虾血淋巴中只存在HDL，不含低密度脂蛋白[27]。杂交子代在内脏团中PPARα的高表达可能表明其消化道对脂肪的吸收转化要高于自繁子代，这一结论还有待于今后的进一步研究。

INSIG-SCAP-SREBP通路是细胞内脂质合成调控的重要通路，其中SREBP是内质网膜上的转录因子。固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)是内质网膜蛋白，SCAP能在内质网上与SREBP结合构成SCAP-SREBP复合物。当细胞内固醇浓度降低时，SCAP可将SREBPs运载至高尔基体，经过两步水解作用释放出具有活性的N末端转录因子片段，并进入细胞核内激活其下游靶基因，即脂肪合成相关酶基因，发挥其转录作用，促进脂质的合成与沉积[28-32]。当细胞内固醇水平升高时，INSIG与SREBP和SCAP相互作用，以INSIG-SREBP-SCAP复合物形式存储在内质网中[33]，即阻止了SREBP向高尔基体的转运，不能激活下游脂肪合成相关基因。本实验中牡蛎闭壳肌中SREBP基因在SA、SS、AA的比值为2.8∶1.5∶1.0，同时杂交子代牡蛎闭壳肌中SREBP基因表达量显著高于SS和AA。牡蛎闭壳肌中INSIG基因在SA、SS、AA的比值为2.2∶2.0∶1.0。杂交子代闭壳肌中SREBP基因的表达量是SS的1.83倍，AA的2.81倍，且均存在显著差异。杂交子代牡蛎闭壳肌中INSIG基因的表达量是SS的1.10倍，AA的2.19倍，虽INSIG同SREBP一样在SA闭壳肌中的表达量高于SS和AA，但从比值来看，SREBP在SA与自繁子代的表达倍数较INSIG在SA与自繁子代的表达倍数更占优势。这与杂交子代牡蛎中粗脂肪含量显著高于自繁子代的结果相吻合。

SS外套膜中SREBP基因表达量均显著高于SA和AA，并且发现对SREBP有一定抑制作用的INSIG基因表达量也显著高于SA和AA。推测当SS中SREBP基因过表达时，SREBP本应激活下游脂合成相关基因，从而合成大量脂质，可INSIG基因表达量也显著高于SA和AA，从而抑制了SS中SREBP向高尔基体的转运，阻止SS合成过多的脂肪酸。SA性腺中SREBP基因表达量显著低于SS和AA，INSIG基因表达量显著高于SS和AA，抑制脂质合成，这与SA总体粗脂肪含量显著高于SS和AA的结果相反，推测维持生物体内脂类平衡的基因有很多，INSIG-SCAP-SREBP通路是其中的一种途径，而在生物体内还存在其他途径，如不饱和脂肪酸生物合成通路(map01040)[34]，其他途径与INSIG-SCAP-SREBP通路共同作用、相互协作，从而维持牡蛎体内脂质的平衡。

3 结语

熊本牡蛎、葡萄牙牡蛎和它们的杂交子代在脂肪的合成和积累上存在显著差异，这一显著差异不仅体现在粗脂肪和脂肪酸含量的不同，还体现在脂肪合成和代谢相关基因的转录水平的不同；杂交子代在脂肪含量、PUFAω3/PUFAω6、DHA和EPA含量上存在杂种优势，可以为人体提供更为均衡的营养，具有一定的养殖潜力和应用价值。

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责任编辑 朱宝象

Determination of Nutritive Components and Expression Analysis of Lipid Metabolism Related Genes of Hybrid of Kumamoto Oyster (♀) and Portuguese Oyster (♂)

YAN Lu-Lu1, WANG Zhao-Ping1, SU Jia-Qi2, YAN Xi-Wu3, YU Rui-Hai1

(1. The Key Laboratory of Mariculture(Ocean University of China),Ministry of Education， Qingdao 266003, China; 2. The South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences,Guangzhou 510300, China; 3. Engineering Research Center of Shellfish Culture and Breeding of Liaoning Province, College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China)

The basic components, amino acids, fatty acids and the expression of three genes related to the lipid metabolism (PPARα,INSIG,SREBP) of one year old oysterCrassostrea.sikamea,C.angulataand their hybrid were determined and analyzed, respectively in this study. The results showed that the content of lipid in hybrid was (13.66±1.99)%, significantly higher than that ofC.sikamea(7.56±1.17)% andC.angulata(5.94±1.88)%. PUFAω3/PUFAω6 ratio was 4.18±0.62 in hybrid, higher than that inC.sikamea(3.86±0.01) andC.angulata(3.14±0.07). The content of DHA in hybrid (16.73±3.35)% was slightly by not significantly higher than that in self-propagated parents. The EPA content of hybrid was between that ofC.sikameaandC.angulata. The expression of lipid genes (PPARα,INSIG,SREBP) in some edible tissues of oysters coincided well with lipid content. The results provided a basis thatnutritional heterosis existed in hybrid.

Crassostreasikamea;Crassostreaangulata; hybrid oyster; nutritional component; gene expression

国家自然科学基金项目(31172403)资助 Supported by the National Natural Science Foundation of China(31172403)

2016-07-08；

2016-12-05

闫路路(1987-)，女，博士生。E-mail：372610194@qq.com

❋❋ 通讯作者：E-mail：zpwang@ouc.edu.cn

S917.4

A

1672-5174(2017)06-053-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20160250

闫路路，王昭萍，苏家齐，等.熊本牡蛎(♀)×葡萄牙牡蛎(♂)杂交子代的营养成分和脂肪代谢相关基因表达分析[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2017, 47(6): 53-60.

YAN Lu-Lu, WANG Zhao-Ping, SU Jia-Qi, et al.Determination of nutritive components and expression analysis of lipid metabolism related genes of hybrid of Kumamoto oyster (♀) and Portuguese oyster(♂)[J]. Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(6): 53-60.