龚 频， 马逢乐， 何蓉蓉， 赵天雷， 常相娜， 陈福欣

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021； 2.暨南大学 中药及天然药物研究所， 广东 广州 510632； 3.西安科技大学 化学与化工学院， 陕西 西安 710054)

云南苦茶提取物对镉致小鼠肝脏损伤的保护作用

龚 频1， 马逢乐1， 何蓉蓉2， 赵天雷1， 常相娜1， 陈福欣3*

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021； 2.暨南大学 中药及天然药物研究所， 广东 广州 510632； 3.西安科技大学 化学与化工学院， 陕西 西安 710054)

研究旨在探究云南苦茶提取物1,3,7,9-四甲基尿酸对镉致小鼠肝脏损伤的保护作用.实验采用腹腔注射氯化镉和灌胃不同浓度四甲基尿酸的方法构建小鼠模型，通过测定其肝脏组织内脂质过氧化(LPO)程度、蛋白羰基化(PCO)程度、超氧化物歧化酶(SOD)活性和过氧化氢酶(CAT)活性，以及一氧化氮(NO)的含量，研究镉对肝脏的氧化损伤程度以及四甲基尿酸的作用效果.实验结果显示，损伤组小鼠在镉的作用下，肝脏中丙二醛(MDA)、PCO和NO的含量增加(p<0.001)，而灌胃不同剂量四甲基尿酸的各保护组MDA、PCO和NO的含量剂量依赖型减少；染镉也致使损伤组中SOD、CAT活性明显下降(p<0.01)，四甲基尿酸则有效缓解SOD、CAT活性的下降，其中在四甲基尿酸浓度分别为20 mg/(kg·d)与30 mg/(kg·d)时都有明显的保护作用.镉对小鼠肝脏造成氧化损伤与镉打破机体的氧化和抗氧化之间的平衡，引起氧化压力的增加有关；四甲基尿酸可能通过提高抗氧化酶活性，增强抗氧化系统的抗氧化能力，以及抗炎作用协同保护肝脏.

云南苦茶； 1,3,7,9-四甲基尿酸； 镉； 肝脏； 氧化损伤

0 引言

镉(cadmium，Cd)是一种人体非必需且有毒的重金属元素.机体吸收后主要在肝脏和肾脏蓄积，且具有代谢率低，生物半衰期长等特点.镉对机体许多组织器官都具有毒性作用[1]，肝脏则是低剂量慢性镉暴露最主要的受损器官之一，本课题组之前的研究也已经证明了镉对肝脏的损伤作用[2]；Habeebu 等给成年雄性小鼠注射氯化镉 (30μmol/L)，小鼠肝脏细胞凋亡结果呈时间-效应关系[3].大量的研究表明镉进入机体后会产生活性氧自由基，进而对机体造成氧化损伤[4].

云南苦茶具有多种潜在的医疗用途，其主要活性提取物1,3,7,9-四甲基尿酸是一种嘌呤生物碱，结构式如图1所示.其结构上类似于咖啡因而作用强于咖啡因，已有研究证明1,3,7,9-四甲基尿酸具有抗炎和止痛的作用[4,5].有研究表明大鼠长期口服苦茶碱单体对大鼠镉染毒产生的氧化损伤的保护反应，或将为苦茶碱开发为药物提供基础[6].因此本实验拟通过构建镉诱导的小鼠肝脏损伤模型，研究四甲基尿酸对镉致肝脏的氧化损伤的保护作用，为四甲基尿酸开发成为重金属镉中毒防治药物提供一定的数据支持和理论依据.

图1 1,3,7,9-四甲基尿酸化学结构式

1 材料和方法

1.1 实验材料

健康清洁级昆明小鼠购自西安交通大学医学院实验动物中心;1，3，7，9-四甲基尿酸(theacrine)提取于云南苦茶;氯化镉(CdCl2)购自天津市福晨化学试剂厂;Coomassie Brilliant Blue G250购于瑞士Adamas公司;4,6-Dihydroxy-2-mercaptopyrimidine(TBA)购于Alfa Aesar;2,4-Dinitrophenylhydrazine(DNPH)购自东京化成工业株式会社;焦性没食子酸购自天津市科密欧化学试剂有限公司；过氧化氢30%购自天津市天力化学试剂有限公司；磺胺购自阿达玛斯公司；N-1-萘乙二胺盐酸盐购自天津市科密欧化学试剂有限公司;其他试剂均为分析纯.

1.2 动物分组和模型构建

昆明小鼠30只，雄性，体重20～30 g，动物模型构建具体如表1所示.所有小鼠被随机分成5组，每组6只，每天早晨定时给药1次，CdCl2的给药量为2 mg/(kg·d)，四甲基尿酸的给药量分别为10 mg/(kg·d)、20 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)，持续给药14天，末次注射后禁食24 h，称重，颈椎脱臼法处死，解剖并切取肝脏样品，于-80 ℃冰箱保存待用.

表1 镉致小鼠肝脏氧化损伤模型的

1.3 测定指标及方法

称取肝脏样品用Ph=7.4的磷酸缓冲溶液制备成10%的组织匀浆，蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝G-250法，LPO采用TBA法测定MDA含量的方法来测定，PCO的测定采用DNPH法，SOD活性测定采用联苯三酚自氧化法，CAT活性采用钼酸铵显色法测定，NO含量采用Griess反应来测定.

1.4 统计学方法

用mean±SE表示实验数据.用单向方差分析法(one-way analysis of variance，ANOVA)和相应的Student′s t-test进行统计学分析(P<0.05具有统计学意义).

2 结果与讨论

2.1 镉的毒性对氧化指标的影响以及四甲基尿酸的保护作用

脂质和蛋白质是活性氧的主要攻击目标.镉的毒性与细胞脂质过氧化反应密切相关[7]，脂质过氧化可以形成以MDA为主的终极产物，MDA的在体液和组织中的含量可以反映体内脂质氧化损伤水平.脂质过氧化之外，蛋白质的过氧化也是机体氧化损伤的结果之一，蛋白质发生氧化后，可在氨基酸链上形成羰基，因而蛋白质羰基化合物的含量可以作为衡量蛋白质氧化损伤程度的指标.

由图2可以看出，小鼠注射氯化镉14天后，损伤组体内MDA含量明显高于空白组(p<0.001)，在喂饲不同浓度的四甲基尿酸以后，能够缓解体内MDA含量的增高(p<0.05)，而且随着四甲基尿酸浓度的升高，MDA的含量呈浓度依赖性的减少，当浓度为30 mg/(kg·d)，保护作用显著(p<0.05).这表明了镉的毒性可以诱发肝脏的脂质过氧化反应，同时四甲基尿酸的保护作用与剂量呈依赖关系.

同样，从图3可以看出镉损伤组蛋白羰基化含量高于空白组(p<0.001，说明镉对小鼠肝脏有明显的氧化损伤作用，当给予不同剂量(20，30 mg/(kg·d))的TC作用后，能够剂量依赖的减少肝脏中PCO的程度(p<0.05,P<0.05), 其中当TC的浓度为30 mg/(kg·d)时，与损伤组相比，PCO的含量降低了54%(p<0.05),结果证明，镉可以使肝脏PCO程度增加，而四甲基尿酸起到保护作用，且与剂量呈依赖关系.

本实验测定了MDA和蛋白羰基化合物的含量，结果显示，镉的毒性作用能明显引起损伤组小鼠肝脏MDA和PCO含量增加，表明镉可能诱导小鼠体内脂质和蛋白质氧化损伤的发生;而四甲基尿酸剂量依赖抑制LPO和PCO含量的增加，对肝脏起到了一定保护作用.

与空白组相比，**P<0.01；与镉损伤组相比,#P<0. 05图2 镉致小鼠肝脏氧化损伤模型中 各组别的脂质过氧化程度

与空白组相比，***P<0.001；与镉致损伤组相比,##P<0.01图3 镉致小鼠肝脏氧化损伤模型中 各组别的蛋白羰基化程度

2.2 镉的毒性对抗氧化酶的影响以及四甲基尿酸的保护作用

SOD和CAT都是生物体内重要的抗氧化酶，广泛存在动物的各个组织中.SOD是生物体内清除活性氧的首要物质.CAT是过氧化物酶体的标志酶, 在肝脏中以高浓度存在，细胞内的CAT可催化过氧化氢的分解，使其生成H2O从而无毒化以此减轻过氧化氢对细胞的氧化损伤，因此，CAT是机体抗氧化防御体系中的一个重要组成部分.

由图4可以看出，建模14天后，损伤组肝脏SOD活性明显低于空白组(p<0.01)，而四甲基尿酸可以有效缓解SOD的这种下降趋势，在浓度为30 mg/(kg·d)，保护效果最为明显，这说明四甲基尿酸在体内可以很大程度的增强SOD的活性，减少了SOD的损耗，从而起到保护作用.

由图5可以看出，镉的毒性可以造成小鼠体内CAT含量的急剧下降(p<0.01)，给与不同浓度四甲基尿酸保护后，缓解了小鼠体内CAT含量的减少，在四甲基尿酸浓度为20 mg/(kg·d)时，效果最明显(p<0.01).

实验结果显示，染镉组肝脏中SOD和CAT活性水平明显降低，可能由于镉与SOD分子中的金属辅基Zn发生竞争性替代作用[8]，消耗并抑制住了SOD的活性，镉毒性作用进而导致肝脏中酶系统正常生理功能的破坏，CAT的活性也受到影响；四甲基尿酸的给予能够有效改变肝脏中SOD和CAT的活性水平，从而减少了酶活性的损耗.

与空白组相比，**P<0.01；与镉损伤组相比,##P<0.01图4 镉致小鼠肝脏氧化损伤模型中 各组别的超氧化物歧化酶活性

与空白组相比，**P<0.01；与镉致损伤组相比,##P<0.01图5 镉致小鼠肝脏氧化损伤模型中 各组别的过氧化氢酶活性

2.3 镉对小鼠肝脏炎症因子的影响及四甲基尿酸的保护作用

NO是一种活性氧成分，在肝细胞的应激损伤中起着重要作用，可与其他自由基结合形成毒性更强的自由基复合物[9].如图6所示，与空白组相比，镉的毒性能够诱发损伤组小鼠肝脏NO含量显著升高(p<0.01)，当给予不同剂量(20，30 mg/(kg·d))的四甲基尿酸作用后，能够剂量依赖的减少肝脏中NO的程度(p<0.05，p<0.05)，在浓度为30 mg/(kg·d)，保护效果最为明显.

本研究表明镉毒性可以诱发小鼠肝脏NO含量的急速增加，造成对肝脏的损伤，而四甲基尿酸可以降低NO含量，说明镉的毒性与NO含量有关.

与空白组相比，*P<0.05；与镉损伤组相比,#P<0.05图6 镉致小鼠肝脏氧化损伤模型中 各组别的一氧化氮含量

3 结论

镉是一种生物蓄积性强，毒性持久，具有多种危害的有毒重金属，肝脏是镉毒性作用的首要靶器官[10,11].镉损伤过程中能够诱导产生氧自由基和脂类自由基[12,13],增加氧化压力，同时改变机体内多种酶的活性，破坏抗氧化系统，造成机体内多器官的氧化损伤与炎症反应.本试验结果表明，镉的毒性能够引起肝脏的过氧化损伤，破坏酶和非酶性抗氧化系统的抗氧化能力，而四甲基尿酸可以有效的缓解镉诱导肝脏氧化损伤，可能与四甲基尿酸改变了部分体内抗氧化酶系统的氧化环境与抗氧化能力相关[14]，如增强抗氧化酶SOD和CAT的活性，拮抗机体的氧化压力，减少NO的生成等.最终通过抗氧化以及抗炎作用协同保护肝脏[15,16]，这进一步阐明了镉致肝脏氧化损伤的作用机制，也为云南苦茶及四甲基尿酸的开发提供了一定的理论依据.

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【责任编辑：蒋亚儒】

Protective effect of theacrine on cadmium-induced mice hepatic damage

GONG Pin1, MA Feng-le1, HE Rong-rong2, ZHAO Tian-lei1,CHANG Xiang-na1, CHEN Fu-xin3*

(1.School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China； 2.Institute of Traditional Chinese Medicine and Natural Products, Ji′nan University, Guangzhou 510632, China; 3.School of Chemistry and Chemical Engineering, Xi′an University of Science and Technology, Xi′an 710054, China)

The study aims to investigate the protective effect of theacrine,the active extractive from Yunnan Bitter Tea,on cadmium-induced liver injury.Animal model were established by treating mice with CdCl2and different concentrations of theacrine.According to the levels of LPO,PCO and activities of SOD,CAT as well as the content of NO,the degree of Cd-induced hepatic injuries and the protective effect of theacrine were assessed.The results indicates that LPO and PCO content increase significantly in damage group compared to control group,and theacrine can reduce this tendency which shows a dose-dependent manner. Meanwhile,the activities of SOD and CAT reduced obviously in the damage group,theacrine can ameliorate these changes effectively. In conclusion,20 mg/(kg·d) or 30 mg/(kg·d) theacrine show an obviously protective effect against the injuries caused by Cd,however,the low concentration 10 mg/(kg·d) had no effect.The intoxication of Cd on mice liver might result from the interruption of the balance between oxidation and anti-oxidation，and then increase the oxidative stress；theacrine shows synergistic protective effect on mice liver by increasing the activity of antioxidant enzymes,enhancing the capacity of antioxidant system and anti-inflammatory properties.

Yunnan Bitter Tea, theacrine； cadmium； liver； oxidative damage

2016-10-11

国家自然科学基金项目(21407104, 81402815)

龚 频(1983-)，女，湖南邵阳人，副教授，博士，研究方向：药理生理通讯作者:陈福欣(1981-)，男，河北吴桥人，副教授，博士，研究方向：药理生理，chenfuxin1981@163.com

1000-5811(2017)01-0134-05

R285.5

A