樊磊，于长青，姚笛，张明玉，李琳

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

植物乳杆菌Lp基因表达时内参基因的选择

樊磊，于长青，姚笛，张明玉，李琳

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

实验以植物乳杆菌Lp为实验材料，用荧光定量PCR技术分析16S r RNA、Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenas、L-lactate dehydrogenase以及recA protein四个候选内参基因的表达情况。应用两种软件geNorm和NormFinder程序对实验结果进行分析。实验结果显示在植物乳杆菌Lp中，稳定值最小的是16S ribosomal RNA，用NormFinder软件分析，稳定值最小的也是16S ribosomal RNA。揭示16S ribosomal RNA适合做植物乳杆菌正常生长状态下的内参基因。

实时荧光定量PCR；植物乳杆菌Lp；内参基因

植物乳杆菌是一类既古老又新颖重要的细菌，是一种革兰氏阳性菌。这类细菌广泛分布在自然界中，尤其在生物体内分布较多[1]。由于这种广泛分布的优势，人们获得植物乳杆菌的途径也增多，因此能更好的将植物乳杆菌应用到人们的日常生活中。目前乳植物乳杆菌已被人们大规模应用到日常生活中，在工业中尤其在食品工业中，植物乳杆菌发挥着很重要的作用。植物乳杆菌能够促进肠道蠕动，改善肠道菌群，因此作为助消化的乳酸菌可被做成乳酸菌素片以及助消化的其他类药物[2]。总之，乳植物乳杆菌与人类生活息息相关，在人类生活的各个领域有很好的应用价值，受到人们的极大重视[3]。因此探究植物乳杆菌基因功能的研究迫在眉睫。

荧光定量PCR技术常用语基因表达的研究，该技术融汇了PCR技术的核酸高效扩增，光谱技术的高敏感性记忆探针技术的高特异性等优点[4]，在进行PCR扩增过程中捕获荧光信号的变换，来获得定量的结果。这是PCR技术从定性到定量的一个质的飞跃[5]。而且它的特异性更强、自动化程度更高，使用范围也更加广阔[6]。随着荧光定量PCR技术的不断进步，该技术已经逐步应用到微生物领域中。在荧光定量PCR中，有两种定量方法，一种是绝对定量，一种是相对定量[7]；绝对定量的宗旨是通过建立样品的标准曲线来测得未知样品的浓度，相对定量是选定一个常用的内参基因做基准，把目的基因与内参基因的比值作为结果进行比较。所以选择一个内参基因对于研究基因表达是很重要的。荧光定量PCR需要有作为校准的内参基因[8]，经过大量的研究表明，没有表达绝对稳定的基因，任何一种内参基因的恒定表达都只是在一定的细胞内或者是规定的实验条件下[9]。所以在进行荧光定量PCR前选择一个合适的内参基因是十分必要的通过大量的研究，发现适合做植物乳杆菌的内参基因有 16S rRNA、rpoA、gyrB、GAPDH、Ldh、Actin、recA等，实验选其中的 16S rRNA、GAPDH、Ldh、recA作为候选基因来确定最适合做植物乳杆菌正常生长状态下表达的内参基因。

1 材料与方法

1.1 菌种

植物乳杆菌Lp由黑龙江八一农垦大学食品生物技术实验室保存。

1.2 试剂

Trizol、DL-2000 DNA Marker、反转录试剂盒、PCR定量试剂盒等购自宝生物（大连）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物设计与合成

表1 内参基因引物信息Table 1 The primer of four reference genes

1.3.2 总RNA提取

实验用Trizol法提取总RNA：8 000 r·min-1，4℃，5 min收集菌体细胞2 mL；倒入液氮研磨成粉状，迅速加入1 mL Trizol，反复抽吸混匀菌体；12 000 r·min-1，4℃，10 min离心收集上清液；将上清液转入新的2 mL离心管，室温静置5 min；加入约0.2 mL的氯仿，用力摇15 s，室温静置3 min；120 000 r·min-1，4℃，离心15 min；将全部液体转入新的1.5 mL离心管，加入约0.5 mL异丙醇，室温静置10 min；120 000 r·min-1，4℃，离心10 min；弃去上清液，加入1 mL 75%乙醇混匀，7 500 r·min-1，4℃，离心5 min，弃去上清液，室温放置10 min；30 μL RNase-free水重溶，60℃水浴10 min，-80℃备用。

1.3.3 cDNA的合成

为了避免RNA的降解，可迅速将琼脂糖凝胶电泳验证成功的RNA进行反转录成cDNA。反转录利用PrimeScriptTM试剂盒进行。实验步骤如下：预先配制反应体系为10 μL的混合液：dNTP Mixture （10 mM each）1 μL；Random 6mers（20 μM）1 μL；Template RNA 5 μL；RNase Free dH2O 3 μL。将上述体系置于PCR仪上进行65℃，5 min的变性、退火反应。将上述产物在Microtube管中配制成反转录反应液，反应体系20 μL：上述反应液10 μL；5×Prime－ScriptTM Buffer 4 μL；RNase Inhibitor（40 U·μL-1）0.5 μL；PrimeScriptTM（for 2 Step）0.5 μL；RNase Free dH2O 5 μL。反转录条件为：30℃，10 min；42℃，30 min；95℃，5min；4℃。得到的cDNA样本于-20℃保存。

1.3.4 内参基因的普通PCR验证

实验选取4个内参基因作为试验的候选基因，通过普通PCR验证在两株植物乳杆菌中存在这4个内参基因。

表2 普通PCR反应体系Table 2 The ordinary PCR reaction system

将上述物质混匀后放入PCR仪，设置PCR扩增条件为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，65℃退火30 s，共计30个循环；72℃，1 min。

1.3.5 内参基因的RT-PCR

对验证成功的内参基因进行荧光定量PCR，以cDNA为模板，配制荧光定量PCR反应体系，配制过程中要最后添加荧光染料，添加染料时要注意避光，尽量不要反复冻融，完全解冻后才能添加，保证染料的均匀。

表3 内参基因PCR反应体系Table 3 The reference gene of PCR reaction system

在小EP管中加入上述物质，每个模板做三个重复。溶液配制过程在冰浴上进行，将配置好的样品放入荧光定量PCR仪中设置反应条件为：95℃，30 sec预变性；95℃，5 sec，60℃，20 sec，40次循环；Melt Curve。

1.3.6 数据处理及软件分析

用Excel2003计算荧光定量PCR所得到的Ct值，得到各基因的相对表达量。然后利用geNorm （http：//medgen.ugentbe/～jvdesomp/genorm）软件分析各内参的表达稳定性，利用NormFinder软件（http：// www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm）对各内参基因的稳定性进行统计分析，通过两个软件的相互配合确定最合适的内参基因，作为后续实验的校正基因。

2 结果

2.1 植物乳杆菌总RNA的提取

植物乳杆菌Lp总RNA琼脂糖凝胶电泳结果见图1，条带清晰完整23S RNA和16S RNA条带清晰可见，经Nanodrop ND-1 000检测，样品的OD260/ OD280比值为1.86，表明总RNA提取效果较好。可用于后续的荧光定量PCR实验。

图1 植物乳杆菌Lp总RNA提取结果Fig.1 Total of RNA extraction of lactobacillus plantarum Lp

2.2 内参基因的普通PCR验证

内参基因的普通PCR验证结果见图2条带1、2，3、4，5、6，7、8分别是16S rRNA、GAPDH、Ldh、recA四种内参基因在植物乳杆菌Lp中的表达，可以看出4种内参基因都有条带，目的条带清晰可见，片段大小符合所设计的大小，说明验证成功，可进行后续的荧光定量PCR。

图2 内参基因在植物乳杆菌Lp中的PCR扩增Fig.2 The PCR amplification of reference genes in lactobacillus plantarum Lp

2.3 内参基因的熔解曲线

图316 S rRNA熔解曲线Fig.3 The melting curve of 16s rRNA

图4 GAPDH熔解曲线Fig.4 The melting curve of GAPDH

图5 Ldh熔解曲线Fig.5 The melting curve of Ldh

图6 recA熔解曲线Fig.6 The melting curve of recA

图7 对照组Fig.7 The control group

从上述图中可以看出，各内参基因在荧光定量PCR时，都只产生单一的熔解峰，样品间的曲线重复性好，而作为参照的未加入模板的无任何信号产生。通过上述结果，说明引物设计的特异性良好，荧光定量PCR反应的特异性高，结果精确可靠。

2.4 geNorm软件和NormFinder软件分析结果

图8 geNorm软件分析植物乳杆菌Lp各内参基因的表达稳定值Fig.8 The stable expression of each reference gene of lactobacillus plantarum Lp value by geNorm

在4个备选内参基因中想要得到其中较为稳定的作为内参基因，利用geNorm软件对四个内参基因的相对表达量进行分析，以植物乳杆菌Lp的cDNA为模板的情况下，得到的结果如图8。在植入乳杆菌Lp中，16S rRNA、GAPDH、Ldh、recA内参基因表达稳定的平均值依次为0.236、0.485、1.032、0.536，表达稳定性排序即为 16S rRNA＞GAPDH＞recA＞Ldh；用NormFinder软件进行分析，在植物乳杆菌Lp中，各内参基因表达稳定值最小的为16S rRNA。

通过geNorm和NormFinder对四个内参基因表达稳定值进行对比分析，结果都证明，在两株菌中16S rRNA的表达稳定值最小，Ldh的稳定值最大。稳定值越小，内参基因越稳定，因此可选择16S rRNA作为荧光定量PCR的内参基因。

表4 NormFinder软件分析各内参基因的表达稳定值Table 4 The expression stability values of the reference genes calculated by NormFinder

3 讨论

对目的基因进行荧光定量PCR前，需要进行内参基因的选择。内参基因的选择通常需要遵循一些原则。如：内参基因在不同类型的细胞、组织中的表达量是相对稳定的；目的基因与内参基因的表达量应接近且内参基因应该呈中度表达；内参基因应为真基因，在细胞中均能够稳定表达。实验选择植物乳杆菌中常用的四个内参基因16S rRNA、GAPDH、Ldh、recA作为候选基因。对候选基因进行荧光定量PCR，通过两个软件geNorm和NormFinder对数据进行分析处理。geNorm软件是通过计算基因的表达稳定值M对基因的表达稳定性进行排序，M值越小，表明稳定性越高。NormFinder软件与geNorm的不同之处是，它可以综合计算内参基因在同组内及不同组间的表达稳定性。两个软件对数据进行处理后得到的结果显示16S rRNA的稳定值最小，所以16S rRNA在两株植物乳杆菌中最适合做内参基因。通过两种软件对结果进行分析能够排除一个软件分析的独断性，得到的结果更有说服力。

［1］潘道东，张德珍.降胆固醇乳酸菌的筛选及其降胆固醇活性研究［J］.食品科学，2005，26（6）：233-237.

［2］王巍，邹积宏，袁杰力.具有降解胆固醇作用益生菌的研究进展［J］.中国微生态学杂志，2009，21（2）：171-176.

［3］刘妍妍，于长青，王瑞辉，等.植物乳杆菌发酵对酸奶中胆固醇含量的影响［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2011，23 （6）：56-59.

［2］施祥林，李东辉.实时荧光定量PCR研究进展［J］.世界华人消化杂志，2005，13（5）：596-599.

［4］孙美莲，王云生，杨冬青，等.茶树实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择［J］.植物学报，2010，45（5）：579-587.

［5］李志强，何德，李翠新.基于兼并引物的PCR扩增特定基因的效果比较［J］.湖北民族学院学报：自然科学版，2015 （2）：170-173.

［6］Santella L，Chun J T.Actin，more than just a house-keeping protein at the scene of fertilization［J］.Sci China Life Sci，2011，54（8）：733-743.

［7］金锐.实时荧光定量PCR应用技术综述［J］.科教文汇，2007（29）：213.

［8］朱芷葳，董常生.持家基因作为相对定量内标物的稳定性比较［J］.生物技术通，2006，17（5）：807-809.

［9］张艳君，朱志峰，陆融，等.基因表达转录分析中内参基因的选择［J］.生物化学与生物物理进展，2007，34（5）：546-550.

Reference Gene Selection of Gene Expression in Lactobacillus Plantarum Lp

Fan Lei，Yu Changqing，Yao Di，Zhang Mingyu，Li Lin
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

The fluorescence quantitative PCR was used to detect the gene expression level of four genes（16S rRNA，Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenas，L-lactate dehydrogenase and recA protein）in Lactobacillus plantarum Lp.The experimental results were analyzed with two kinds of software geNorm and NormFinder program.The result showed that the stable minimum value was 16s rRNA in the two software.16s rRNA was suitable for the reference gene in Lactobacillus plantarum Lp.

real-time fluorescence quantitative PCR；Lactobacillus plantarum Lp；reference gene

Q78

A

1002-2090（2016）05-0051-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.05.010

2015-03-10

黑龙江省自然基金重点项目资助（ZD201207）；黑龙江省博士后专项经费资助（LBH-Q13133）。

樊磊（1989-），女，黑龙江八一农垦大学食品学院2012级硕士研究生。

于长青，男，教授，硕士研究生导师，E-mail：spxypjb@126.com。