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慢性疼痛的表观遗传调节机制—DNA转甲基酶DNMT3a通过抑制Kcna2在DRG中的表达参与神经病理性疼痛

神经损伤诱导了背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）中的神经元基因转录发生变化，这可能会造成神经性疼痛的发生,而DNA的甲基化能够抑制基因的表达。本研究发现：外周神经损伤通过活化八聚体转录因子1可以增加DRG神经元中DNA甲基转移酶DNMT3a的表达。如果阻断这种改变可以阻止电压依赖性钾离子（Kv）通道亚单位Kcna2启动子区的DNA甲基化发生，进而抑制神经损伤诱发的DRG中的Kcna2表达降低，从而抑制神经病理性疼痛。相反，即使没有神经损伤，在DRG中上调DNMT3a的表达，也可以降低Kcna2的表达，减少Kv电流，增加了DRG神经元兴奋性并导致脊髓中枢敏化，诱发动物出现神经病理性疼痛的症状。这些发现表明在DRG神经元中甲基转移酶DNMT3a可能通过抑制Kcna2的表达，从而调控神经病理性疼痛。

神经病理性疼痛是一种多发性的慢性疼痛，仅在美国就有超过5 000万的病人。神经病理性疼痛的有效治疗是世界性的难题，其中一个重要的原因就是其确切的发病机制尚不清楚。来自新泽西州立大学医学院的陶元祥教授课题组的最新一篇文章表明，背根神经节中钾离子通道的表观遗传调控可能在神经病理性疼痛的病理进程中发挥了重要作用。

控制静息膜电位和DRG神经元兴奋性的电压门控制通道被认为是神经性疼痛发生的关键因素。以往的研究中，大部分疼痛研究者将目光聚焦在痛觉神经元兴奋性升高的“正向”信号上，例如钠离子通道Nav1.7和Nav1.8的表达量上调及兴奋性增强等，而关注痛觉信号中“负向”信号—电压门控性的钾离子通道等的研究相对比较少。周围神经损伤可以导致电压门控制钾离子通道的表达明显下降，比如被Kcna2编码的Kv1.2，在损伤DRG中转录和翻译水平中均下降，提示Kv1.2可能参与了神经性疼痛的形成。但是Kv1.2的下调是通过何种机制来实现，目前尚不清楚。

DNA甲基化是表现修饰的一种重要类型，它抑制基因的表达。DNA的甲基化首先是由DNA甲基转移酶(DNMT)家族触发的，包括DNMT1，DNMT3a和DNMT3b。一般而言，DNMT1的作用主要是维持已经建立的基因组上DNA的甲基化，而DNMT3a和DNMT3b则被称为从头合成的甲基转移酶，可以转换已甲基化和未甲基化的DNA。DNA甲基化抑制基因转录的机制主要包括生理性阻碍转录因子之间的联系和/或作为转录抑制子/辅助抑制子的停泊位点。虽然一些表观遗传调控机制（如组蛋白修饰和非编码RNAs）近期已在动物模型中被证实与神经病理性疼痛密切相关，甲基转移酶DNMTs如何调控神经病理性疼痛的发生仍然不清楚。

研究者本研究首先考察了周围神经损伤后DNMT3a在DRG中的表达情况。结果发现：周围神经损伤后DNMT3a而不是DNMT3b在DRG中表达增加。研究者通过TFSEARCH软件，研究者在Dnmt3a基因的启动子区定义了一段八聚体转录因子1 (OCT1)识别的结合序列。通过染色质免疫沉淀(ChIP)试验发现了在Dnmt3a基因启动子区域中包含上述结合序列的片段(-499AATGACAT-442)。脊神经结扎损伤能显著增加Dnmt3a与该序列的结合活性。而在细胞实验中，过表达OCT1能够明显增加Dnmt3a基因转录子活性。单细胞RT-PCR分析也证实了DRG神经元中，Oct1 mRNA和Dnmt3a mRNA存在共表达。综上以上数据，研究者认为OCT1在外周神经损伤后促进了DRG Dnmt3a基因活性。

随后研究者考察了抑制DRG 的DNMT3a能否改善神经病理性疼痛。研究者构建了包裹Dnmt3a shRNA的特异性AAV5病毒。无论是脊神经结扎还是坐骨神经结扎模型，小鼠注射AAV5-Dnmt3a shRNA后，其疼痛行为学反应均被显著改善。考虑到shRNA可能的脱靶效应，研究者用了另一个方法，使用Dnmt3a fl/ fl的小鼠，在脊神经损伤手术前，将AAV5-Cre注射入同侧的L4DRG中。注射了AAV5-Cre的Dnmt3a fl/ fl小鼠在造模以后，其疼痛程度明显减轻。这个结果令人信服地证明，早期增加的DRG Dnmt3a对神经性疼痛的发展是必需的。

研究者接着提出问题，DRG Dnmt3a的早期增长对神经性疼痛的诱导是否是足够？另一方面，如果在DRG中过表达 Dnmt3a是否会导致痛觉超敏。研究者将表达全长Dnmt3a的AAV5病毒注射入普通成年小鼠L4和L5的一侧DRG中。四周后，Dnmt3a mRNA和蛋白质表达量显著增加，同时注射AAV5-Dnmt3a的小鼠的应答机械刺激和冷热刺激的后足收缩潜伏期均表现出显著的降低。这种下降在注射后4周开始发生并持续至少8周。类似的结果在给小鼠L3-4单侧DRG注射表达全长Dnmt3a的HSV病毒载体后同样可观察到。这些发现表明DRG中增加的Dnmt3a，在没有神经损伤时，就可以引起机械痛觉和冷热痛觉过敏，诱发动物出现神经病理性疼痛的临床症状。这些行为学表现同时伴随着脊髓背侧角的中枢敏化证据。在HSV-Dnmt3a注射后6天，注射同侧的脊髓背角中，磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)和胶原细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)的水平显著增加。这些数据均证明DRG中Dnmt3a的过度表达足以导致痛觉超敏反应的发生。

在揭示了Dnmt3a与神经病理性疼痛的相关性以后，研究者考察了DRG中Dnmt3a促进神经病理性疼痛发生的机制。研究者发现，神经损伤后DRG中Kcna2下调是疼痛形成的内因。脊神经结扎损伤后7天，在L5的DRG中注射AAV5-Dnmt3a shRNA能够逆转Kcna2 mRNA和蛋白质的下降。同样，Dnmt3a fl/ fl小鼠在外周神经损伤后7天在损伤同侧L4DRG注射AAV5-Cre，同样恢复了损伤侧 DRG中Kcna2 mRNA和蛋白质的表达水平。同时AAV5-Dnmt3a shRNA和AAV5-Cre都不影响外周神经损伤诱导的DRG中Kcna1和Kcna4 mRNA的减少。另一方面，L4和L5的DRG注入AAV5-Dnmt3a5周后， Kcna2 mRNA和蛋白质的水平明显下降。而Kcna1和Kcna4 的mRNA和蛋白质表达并无明显改变。考虑到Kcna2阳性的DRG神经元中大约62.1%同样看到DNMT3a阳性，所以很可能在DRG神经元中DNMT3a直接调控了Kcna2的表达。研究者发现DRG神经元中Dnmt3a的过表达，确实可以降低Kcna2 mRNA的水平。同时DRG神经元Dnmt3a的下调也能够增加Kcna2 mRNA的表达。这些证据均表明，在损伤侧的DRG中，Dnmt3a参与了神经损伤诱导的Kcna2下调。同时研究者还利用ChIP试验发现Dnmt3a与Kcna2基因启动子的两个区域结合（-663/-389bp和-491/-199bp）。重亚硫酸氢钠焦磷酸测序试验进一步证实在神经损伤后，Kcna2基因的-457和-444 CpG区域DNA甲基化增加。这两个区域可能与Kcna2转录密切相关，因为Kcna2启动子活性在-457和-444 CpG 区域去除后会显著增加，Dnmt3a 的过度表达能显著降低Kcna2启动子的活性。这些发现表明DNMT3a诱导Kcna2启动子区的-457和-444区域DNA甲基化与DRG神经元中的Kcna2基因沉默有关系。

最后，研究者考察了了外周神经损伤诱导的DRG 中DNMT3a的增加是否会影响神经元的Kv电流。注射AAV5-Dnmt3a病毒溶液后5～8周，DRG细胞被分离出来并且进行全细胞电压钳记录来考察Kv电流。注射AAV5-DNMT3a组的大、中、小DRG神经元的总体Kv电流密度场显著下降。为了证实Kv电流下降是否由于Kcna2的下调，研究者使用选择性的Kcna2抑制剂MTX来处理DRG细胞。结果发现，当测试电压为+50 mV时，对照组用MTX处理后，大或中神经元的总体Kv电流与MTX处理前相比，分别下降了28%和32%；但是DNMT3a注射组在用MTX处理后，大和中神经元的总Kv电流与处理前相比只下降了13%。对照组和DNMT3a注射组的小型DRG神经元的Kv电流不受MTX影响。这一证据表明，只有在大和中DRG神经元中，Kcna2关联的电流表现出明显的下降。除了Kv电流，研究者还检测了DRG神经元的兴奋性。在病毒注射后5～8天，进行了全细胞电压钳记录。与对照组相比，DNMT3a注射组的大、中、小型神经元的静息膜电位分别增加了11.98，12.01和7.63 mV，而电流阈值分别降低了40%，49%和40%。更重要的是，在大型，中等和小型神经元中，DNMT3a的注射使得被≥200 pA刺激所激活的电位数目显著增加，尽管这种注射并不改变膜输入电阻或其他动作电位参数，如振幅，阈值，持续时间，过冲，后超级化振幅等。这些数据表明在DNMT3a过表达会导致DRG神经元兴奋性显著增加。

综上所述，本研究发现了周围神经损伤会通过激活转录因子OCT1促进DRG神经元中的DNMT3a表达增加。这种增加与Kcna2启动子区中部分CpG区域中DNA离度甲基化密切相关，也与Kcna2表达下调密切相关。考虑到DRG Kcna2下调促进了神经性疼痛的形成，DNMT3a在神经病理性疼痛的进程中发挥了重要作用。不过研究者也指出，周围神经损伤可能通过多种机制来促进DRG中Kcna2的下调。除了目前研究中已显示的DNMT3a的作用以及已经揭示的内源性非编码Kcna2 反义RNA的作用外，陶教授组的研究还证实，G9a触发的组蛋白甲基化在损伤DRG中也参与神经损伤诱导性Kcna2沉默。这些表观机制如何共同协作来调节Kcna2的表达以及它们在神经损伤时是否相互联系/或影响其它靶点，目前现在还不清楚。同时值得注意的是，DNMT3a在其他组织也有表达，所以除了Kcna2之外，DNMT3a还可能靶向其他基因。因此，DNMT3a抑制剂所造成的潜在副作用需要进一步仔细探究。

(Jian-Yuan Zhao, Ling-li Liang, Xi-yao Gu,et al.DNA methyltransferase DNMT3a contributes to neur-opathic pain by repressing Kcna2 in primaryafferent neurons.nature communication,2017, 8.DOI: 10.1038/ncomms14712.刘文涛 译 高永静 校)

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.08.003